系統性紅斑狼瘡患者血清抗核抗體免疫熒光核型與特異性抗體譜的相關分析

晁亞妮，蓋玉萍，趙詠梅，何華月，白文棟，鄒紅云

（新疆軍區總醫院a.檢驗科；b.血液科，烏魯木齊 830000）

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種由免疫介導的、多種炎癥因子共同參與的自身免疫性疾病，其病因和發病機制至今尚無明確定論。多種自身抗體的產生是SLE的重要病理過程之一，自身抗體的產生及免疫復合物的形成并沉積可造成多個器官受累，這類抗體通常總稱為抗核抗體（antinuclear antibodies,ANA），ANA檢測在SLE等自身免疫性疾病的診斷和鑒別診斷中具有重要意義[1]。臨床上常采用間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence,IIF）作為檢測ANA總抗體的篩查實驗，IIF-ANA檢測基質含有較完整的細胞成分抗原譜，能夠針對細胞中的抗原出現特異性的熒光核型，檢測靈敏度較高，但IIF-ANA不能提示具體的靶抗原，特異度低。線性免疫印跡（line-blot immunoassay-LIA）法是臨床中應用較為廣泛的一種特異性抗體分型確認實驗，特異度高，一次實驗可以同時檢測多種特異性自身抗體，但目前能檢出的特異性抗體種類還十分有限。在臨床工作中常常出現ANA免疫熒光篩查與線性免疫印跡檢測結果不相符的情況，為此，本研究通過回顧性分析263例SLE患者ANA免疫熒光篩查與特異性抗核抗體譜（antinuclear antibody profile,ANAs）檢測結果，探討二者之間的相關性，以期為SLE的準確診斷和及時治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2015年1月～2018年12月在本院住院確診為SLE患者263例，其中男性41例，女性222例，年齡15～85歲，排除其他并發的自身免疫性疾病及腫瘤。所有患者診斷標準均符合1997年美國風濕病學會修訂的SLE分類診斷標準。收集患者性別、年齡、民族、ANA免疫熒光（IIF-ANA）篩查和特異性抗核抗體譜線性免疫印跡（LIA-ANAs）檢測結果等信息。

1.2 試劑與儀器 試劑均購自歐蒙（杭州）醫學實驗診斷有限公司；Nikon 80i熒光顯微鏡，EURO Blot MasterⅡ全自動免疫印跡儀，佳能Lide100掃描儀。

1.3 方法

1.3.1 ANA檢測：采用間接免疫熒光法（IIF），以猴肝片及Hep-2細胞作為抗原基質進行檢測。檢測結果判讀由經驗豐富的檢驗醫師在免疫熒光顯微鏡下觀察HEp-2細胞的熒光染色情況，若無特異性綠色熒光則為陰性，若特異性熒光較強則為陽性，并報告相應的免疫熒光模型。陽性血清按照1∶100，1∶320，1∶1 000，1∶3 200和1∶10 000稀釋梯度確定抗體最終滴度。

1.3.2 ANA譜（ANAs）檢測：采用線性免疫印跡法（LIA）檢測15種特異性IgG類抗體：抗核糖核蛋白（ribonucleoprotein,RNP）抗體、抗史密斯（Smith,Sm）抗體、抗舍格倫綜合征抗原A（sjogren’s syndrome antigen A,SSA）抗體、抗舍格倫綜合征抗原B（sjogren’s syndrome antigen B，SSB）抗體、抗Ro-52（Ro-52）抗體、抗雙鏈DNA(double stranded DNA，dsDNA)抗體、抗核小體（nucleosome,NUC）抗體、抗組蛋白(Histones,HI)抗體、抗硬皮病-70(scleroderma-70，Scl-70)抗體、抗多發性肌炎/硬皮病(polymyositis-scleroderma,PM-Scl)抗體、抗核糖體P蛋白(ribosome P-protein,RIB)抗體、抗組氨酰tRNA合成酶(Jo-1)抗體、抗線粒體抗體-M2型（anti-mitochondrial antibody-M2,AMA-M2）、抗增殖細胞核抗原抗體（proliferating-cell nuclear antigen antibody,PCNA）和抗著絲點蛋白B（centromere protein B,CENP-B）抗體。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，計數資料以[n（%）]表示，多組間的比較采用R×C表χ2檢驗；配對資料的比較采用McNemarχ2檢驗，一致性分析采用Kappa檢驗，一致性程度根據Kappa值范圍進行判斷：Kappa＜ 0.4，兩者一致性較差；0.75＞Kappa≥0.4，為一致性一般；Kappa≥0.75，為一致性較好。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 IIF-ANA與LIA-ANAs檢測結果比較 見表1。263例SLE患者血清IIF-ANA檢測陽性率為94.29%（248/263），LIA-ANAs檢測陽性率為89.73%（236/263），二者差異無統計學意義（χ2=3.726，P＞ 0.05）；IIF-ANA和LIA-ANAs檢測結果的總體一致率為89.35%（235/263）；對兩種方法檢測結果符合率進行統計學分析（配對設計的McNemarχ2檢驗）結果表明，兩種方法檢測結果不一致，差異具有統計學意義（χ2=2.63，P＜ 0.05）；一致性分析結果提示兩種檢測方法一致性較差，Kappa=0.281，＜ 0.4，P＜ 0.05。

表1 IIF-ANA和LIA-ANAs檢測結果比較[n (%)]

2.2 IIF-ANA陽性病例中ANA抗體滴度分布及ANAs陽性率 見表2。IIF-ANA陽性病例中，隨著ANA滴度增加，LIA-ANAs陽性率增高；不同ANA滴度組間LIA-ANAs陽性率差異具有統計學意義（P＜ 0.05），進一步兩兩比較結果表明：滴度1:1 000病例組LIA-ANAs陽性率顯著高于滴度1:100病例組（χ2=11.65，P＜ 0.05）；滴度≥1∶3 200病例組陽性率顯著高于滴度1:100病例組（χ2=12.82，P＜ 0.05），也顯著高于滴度1:320病例組（Fisher精確檢驗P＜ 0.05）。

表2 IIF-ANA陽性病例抗體滴度分布及LIA-ANAs陽性率

2.3 SLE患者ANA 免疫熒光核型與ANAs特異性抗體分布情況248例IIF-ANA陽性患者熒光核型主要包括核顆粒型（68.55%，170/248）、核均質型（32.26%，80/248）、胞漿顆粒型（13.31%，33/248）、核仁型（4.84%，12/248）和著絲點型（2.82%，7/248）；236例LIA-ANA陽性患者ANAs檢出率分別為：SS-A 66.95%（158/236），ds-DNA 55.51%(131/236)，Ro-52 52.12%（123/236），RNP 44.92%（106/236），NUC 33.90%（80/236），HI 33.05%（78/236），RIB 26.27%（62/236），Sm 23.73%（56/236），SS-B 15.25%（36/236）。

對IIF與LIA同時為陽性的228例患者ANA核型與ANAs特異性抗體結果對比分析，見表3。不同的ANA熒光核型中檢出的特異性抗體種類有所不同，核顆粒型以ds-DNA和抗RNP抗體為主，核均質型以ds-DNA和抗核小體抗體為主，胞漿顆粒型以抗RNP和ds-DNA抗體為主，核仁型以ds-DNA抗體為主，著絲點核型主要為CENP-B抗體，陽性率為100%。

3 討論

自1957年Holborow及Friou等首先以嚙齒動物組織冷凍切片為抗原底物，應用間接免疫熒光技術（IIF）檢測ANA以來，臨床上常規檢測ANA一直沿用IIF法作為ANA總抗體的篩查實驗，以Hep-2細胞為基質的IIF-ANA檢測是自身免疫性疾病重要的篩查實驗[2-3]。IIF-ANA檢測易于觀察熒光滴度和特征性免疫熒光核型。但IIF-ANA檢測結果受主觀判斷影響較大，熒光核型對特異性自身抗體的提示作用也較為局限。LIA-ANAs檢測操作簡便，具有較高的靈敏度和特異度，因此，作為ANA檢測“金標準”的IIF方法受到嚴峻的挑戰[4]。

本研究結果表明IIF-ANA和LIA-ANAs兩種方法在SLE患者檢測陽性率無顯著性統計學差異，二者總體符合率較高（為89.35%）,但是仍然存在IIF-ANA與LIA-ANAs檢測結果不相符的情況。

表3 不同熒光核型中ANAs特異性抗體分布情況[n (%)]

對兩種方法檢測結果的符合率和結果一致性進行統計學分析，結果提示兩種方法檢測結果不一致，兩種檢測方法一致性較差，其原因主要是由于檢測方法不同所致。IIF法玻片基質上覆蓋的細胞成分抗原譜種類多，而LIA法檢出的抗體種類有限，這可能是造成IIF陽性而LIA陰性的主要原因。而IIF陰性LIA陽性可能是由于LIA膜條條帶所包被的抗原純度和特異度較高，而IIF檢測基質中抗原分布不均勻、含量少等因素所致[5]。例如，SS-A抗原在Hep-2細胞中含量少，在制作基質時容易漏出而無法檢測[6]；也有報道SLE患者由于藥物治療或處于發病早期或者大量蛋白經尿液排出而出現IIF-ANA陰性報道[7]，本研究也進一步證實IIFANA陰性SLE病例的存在。

一般而言，免疫熒光抗體滴度越高,與疾病的相關性越強，對疾病的預示性越明確。本研究中IIF-ANA陽性的SLE患者具有不同的ANA抗體滴度水平，這可能與患者處于不同疾病病程或藥物治療等因素有關。隨著ANA滴度增加，LIAANAs的陽性率也呈增高趨勢，與已有報道結果一致[8]，其原因可能是由于ANA滴度越高，血清標本中ANA抗體含量和特異性抗體種類也越多，因此ANAs檢出率越高。

本研究中SLE患者IIF-ANA熒光核型以核顆粒型最為多見（占68.55%），與既往報道較一致[9-11]。其次為核均質型（32.26%），而其他核型（胞漿顆粒型13.31%、核仁型4.84%、著絲點型2.82%）陽性人數較少，這與既往報道的結果有一定偏差[9-11]，可能是由于不同研究對象的疾病構成不同所致。

對SLE患者ANAs特異性抗體譜分析表明，ds-DNA,RNP和核小體抗體在SLE中檢出陽性率較高，是SLE較為敏感和特異抗體，與近期劉衛霞等[12]研究結果一致。ds-DNA抗體在各種核型中（除著絲點型未檢測到ds-DNA外）陽性率均較高，在核均質型中陽性率最高（為72.5%），表明ds-DNA抗體對SLE診斷最為敏感和特異，應作為SLE血清學篩查的首選指標,核均質型對于SLE診斷的提示作用較大。

Sm抗體對SLE診斷也具有較高特異度，但敏感度較低，本研究中Sm抗體在不同核型中的陽性率（8.33%～29.41%）均較低，與文獻報道一致[12]。SS-A和Ro-52抗體是與舍格倫綜合征密切相關的特異性抗體，在多種自身免疫病中出現頻率都較高，本研究SLE病例中SS-A和Ro-52抗體的檢測陽性率也較高，與既往文獻中報道相一致[13-14]。

綜上所述，在SLE實驗診斷中，IIF法檢測ANA具有全面性，LIA法檢測ANA譜具有檢測的特異性，ds-DNA，RNP和核小體抗體對SLE診斷價值較高，在IIF-ANA篩查的同時進行LIA-ANAs特異性抗體確認實驗檢測，兩種方法互補，可避免僅單獨采用一種方法檢測導致的漏診，提高檢出率，為SLE的準確診斷和及時治療提供有價值的參考依據。