HMMR-AS1在子宮內(nèi)膜癌化療耐藥中的作用

王 娟，劉 鑫，席穩(wěn)燕

(1.西安大興醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710016；2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科,西安710004)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer，EC)是我國婦女常見的惡性腫瘤[1-3]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率及其病死率均居高不下，且因為人口老齡化等因素，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率仍有進一步上升的危險[4]。子宮內(nèi)膜癌目前的治療手段主要為手術(shù)切除癌組織，輔以化療和放療[5]。手術(shù)切除術(shù)的缺點主要為復(fù)發(fā)率及遠處轉(zhuǎn)移率較高，輔助化療和放療雖能降低復(fù)發(fā)和遠端轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，但仍有相當部分患者因化療耐藥而出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的情況[6-7]，因此，對子宮內(nèi)膜癌化療耐藥的機制進行研究對子宮內(nèi)膜癌患者具有較大的現(xiàn)實意義。長鏈非編碼RNA(long non coding RNAs,lncRNAs)作為新興的研究熱點，被發(fā)現(xiàn)在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，如SHEN等[8]研究發(fā)現(xiàn)，漿細胞瘤多樣異位基因1（plasmacytoma variant translocation gene 1，PVT1）在表觀遺傳學(xué)上沉默miR-195，并調(diào)節(jié)腫瘤細胞上皮細胞-間光質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）導(dǎo)致宮頸癌細胞化療耐藥；王棟等[9]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在結(jié)直腸癌中高表達，且其高表達能夠介導(dǎo)結(jié)直腸癌患者化療耐藥。HMMR-AS1最早被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中高表達，且其高表達與HMMR呈正相關(guān)[10]。目前尚未發(fā)現(xiàn)其在子宮內(nèi)膜癌中所起作用的報道。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究收集了西安大興醫(yī)院2012年1月～2016年12月手術(shù)切除的80例子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織及其配對正常組織。本研究經(jīng)西安大興醫(yī)院倫理委員會批準，以上所有子宮內(nèi)膜癌患者手術(shù)前均未接受任何放療和化療治療及激素治療，且所有患者均無其他腫瘤，相互之間不存在親緣關(guān)系。所有組織均為手術(shù)切除后30min內(nèi)浸泡于RNAlater液中，24h后置于液氮中保存。

1.2 儀器與試劑 PCR儀器使用ABI公司7500型PCR儀（美國），PCR master Mix使用ABI公司配套試劑(美國)，引物由上海生工合成（中國上海），Ishikawa細胞系購買于上海斯信生物公司（中國），慢病毒載體由Genecopoia公司合成（美國），CCK8試劑、5-FU,順鉑由肖鵬生物公司購買（中國）。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取及實時熒光定量PCR：使用trizol法提取組織中的總RNA，使用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板備用。使用ABI公司7500型PCR儀進行實時熒光定量PCR實驗。反應(yīng)體系嚴格按照ABI公司提供的說明書配置。各基因PCR引物為：DNAJC3-AS1上游引物為：5’-AGCGATTGTGGAAGACCCTG-3’；下游引物為：5’-ATTTCCCCTGGTAAGCGCAA-3’；DNAJC3上 游引物為：5’-GCCACACACCTTTCCTCCTC-3’，下游引物為：5’-GCAGATCCACCAGGACTAGC-3’； 使用ACTB作為內(nèi)參，上游引物為:5’-GGCGGC ACCACCATGTACCCT-3’，下游引物為：5’-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3’。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性10min；94℃10s，65℃1min；共計40個循環(huán)。實驗結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行分析，實驗結(jié)果使用該基因在腫瘤組織中表達量的中位數(shù)作為臨界值，大于等于中位數(shù)的為高表達，反之為低表達。

1.3.2 細胞培養(yǎng)：本實驗所用人子宮內(nèi)膜癌細胞系(Ishikawa)購于上海斯信生物公司，本實驗細胞培養(yǎng)使用含10m1/dl胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)條件為37℃，5ml/dl CO2，飽和濕度。待細胞匯合度達80%左右時使用胰蛋白酶消化傳代細胞。

1.3.3 細胞轉(zhuǎn)染：本研究采用慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染包裝系統(tǒng)進行過表達和干擾實驗，所用載體分別為PEZ-LV201和psi-LVRH1GH。實驗過程中，通過熒光檢測及實時熒光定量PCR進行確認，兩項均顯示轉(zhuǎn)染成功后使用該細胞進行后續(xù)實驗。以上兩種載體均為嘌呤霉素抗性載體。本研究擬通過過表達及干擾HMMR-AS1在子宮內(nèi)膜癌細胞中表達后檢測細胞耐藥等能力的改變情況，檢測其對常見化療藥物敏感性的變化趨勢。轉(zhuǎn)染所用試劑為Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)，操作步驟嚴格按照Invitrogen公司說明書進行，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48h后，收集對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗檢測。

1.3.4 CCK-8實驗：取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期子宮內(nèi)膜癌細胞用于此實驗。實驗中，取胰蛋白酶消化重懸后的子宮內(nèi)膜癌細胞計數(shù)，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200個細胞，每組設(shè)置5個平行孔；接種5個96孔板用于不同時間點(0，24，48，72和96h)加入CCK-8試劑后在450nm波長下檢測其吸光度值，吸光度值愈高則表示孔內(nèi)細胞越多。

1.3.5 化療敏感性實驗：取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的子宮內(nèi)膜癌細胞用于此項實驗。本實驗采用加入化療藥物后檢測各組子宮內(nèi)膜癌細胞生長抑制情況差異來分析HMMR-AS1不同表達水平下對化療藥物敏感性的差異。實驗中，取胰蛋白酶消化重懸后的子宮內(nèi)膜癌細胞計數(shù)，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種2×104個細胞，每組設(shè)置5個平行孔；按對數(shù)濃度梯度設(shè)置化療藥物(5-FU，順鉑)的濃度地圖加藥，常規(guī)培養(yǎng)24h后PBS清洗96孔培養(yǎng)板，加入含20g/dl CCK-8試劑的培養(yǎng)基，2h后在450nm波長下檢測其吸光度值，吸光度值愈高則表示孔內(nèi)細胞越多。

1.3.6 Western blot實驗：取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期細胞用于此實驗。本實驗所用一抗(ab124729)及二抗(ab205718)均購買自ABcam公司，實驗過程中，一抗稀釋倍數(shù)為2 000倍，二抗稀釋倍數(shù)為1 000倍。實驗過程為典型的Western blot實驗過程，具體步驟參見文獻[11]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用配對t檢驗分析癌組織和對應(yīng)癌旁正常組織中l(wèi)ncRNA表達水平的差異，采用卡方檢驗和獨立樣本t檢驗分析不同宮頸癌患者臨床特征及疾病進展中l(wèi)ncRNA表達水平的差異，采用K-M法繪制生存曲線，用log-rank檢驗不同組患者生存時間之間的差異。采用重復(fù)測量的方差分析方法分析細胞增殖能力的差異(CCK-8實驗及化療藥物敏感性實驗)。統(tǒng)計過程使用實驗SPSS18.0軟件運行，所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，α=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMMR-AS1在子宮內(nèi)膜癌中高表達 見圖1。經(jīng)實時熒光定量PCR實驗檢測所有80對宮頸癌-癌旁正常組織，癌組織中的表達量顯著高于對應(yīng)癌旁正常組織，平均達7.24倍(P＜0.01)。

圖1 HMMR-AS1在子宮內(nèi)膜癌中高表達

2.2 HMMR在子宮內(nèi)膜癌中高表達 經(jīng)實時熒光定量PCR實驗檢測80對宮頸癌-癌旁正常組織，癌組織中的表達量顯著高于對應(yīng)癌旁正常組織，平均達2.50倍，見圖2A(P＜0.01)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)HMMR-AS1表達量與HMMR表達呈正相關(guān)，見圖2B(r2=0.763 5，P＜0.01)。

2.3 轉(zhuǎn)染實驗 見圖3。通過熒光顯微鏡初步確認轉(zhuǎn)染成功后，收集轉(zhuǎn)染細胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后使用實時熒光定量PCR實驗確認轉(zhuǎn)染是否成功。圖A為熒光照片，B，C為qPCR實驗結(jié)果，其中過表達平均為對照組的8.63倍，干擾后表達為對照組的0.07倍。

圖2 HMMR在子宮內(nèi)膜癌中高表達

圖3 轉(zhuǎn)染實驗的驗證

2.4 過表達HMMR-AS1促進細胞增殖 通過CCK-8實驗檢測過表達組與對照組細胞、干擾組及對照組細胞增殖情況，結(jié)果顯示，第2～4天，過表達組子宮內(nèi)膜癌細胞在450nm下的吸光度值顯著高于對照組，見圖4A。經(jīng)t檢驗，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。通過干擾HMMR-AS1表達后檢測其對子宮內(nèi)膜癌細胞系增殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)24h后即可觀察到兩組細胞增殖能力的差異，即24h后對照組細胞明顯強于干擾組，見圖4B(P＜0.01)。表明過表達HMMR-AS1能夠促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，干擾HMMR-AS1能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細胞系增殖。

2.5 過表達HMMR-AS1降低化療藥物敏感性 通過檢測子宮內(nèi)膜癌細胞系對順鉑及5-FU兩種藥物的IC50，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌細胞系對順鉑的IC50為45.23ng/ml，對5-FU的IC50為15.94 ng/ml。通過改進CCK-8實驗檢測過表達組與對照組細胞在HMMR-AS1異常表達情況對化療藥物(順鉑、5-FU)敏感性的影響，結(jié)果顯示，第2～4天，過表達組子宮內(nèi)膜癌細胞在450nm波長下的吸光度值顯著高于對照組（見圖5A，5B)，經(jīng)t檢驗，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。干擾HMMR-AS1后則能觀察到相反的效應(yīng)：即HMMR-AS1干擾組對順鉑及5-FU的敏感性均增加，見圖5C，5D(均P＜0.05)，表明過表達HMMR-AS1能降低子宮內(nèi)膜 癌細胞對順鉑及5-FU的敏感性。

圖4 過表達HMMR-AS1促進細胞增殖(*P＜0.05，**P＜0.01)

圖5 過表達HMMR-AS1降低化療藥物敏感性(*P＜0.05，**P＜0.01)

2.6 過表達HMMR-AS1促進HMMR蛋白質(zhì)表達增加 見圖6。通過western blot實驗檢測過表達HMMR-AS1的子宮內(nèi)膜癌細胞及對照組細胞的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)過表達組HMMR蛋白顯著高于對照組。

圖6 過表達HMMR-AS1促進HMMR蛋白質(zhì)表達增加

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生在子宮內(nèi)膜上的一種上皮惡性婦科腫瘤[12-14]，主要發(fā)生于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后的女性，給全世界女性帶來了嚴重的健康問題[15]。目前子宮內(nèi)膜癌的主要治療手段為手術(shù)切除，并使用放療和化療輔助治療，但目前手術(shù)后患者仍有較高風(fēng)險出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其中一個重要原因即為患者對化療藥物產(chǎn)生耐受，此外，放療患者易出現(xiàn)部分腫瘤干細胞不能被射線殺滅的情況，進而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌出現(xiàn)較高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良。近年來研究顯示，lncRNA在腫瘤化療耐藥中發(fā)揮重要調(diào)控作用[16-17]。

有研究報道，HMMR-AS1在乳腺癌中高表達；在上皮性卵巢癌中高表達，且可作為獨立的預(yù)后因子[18]；在惡性膠質(zhì)瘤中高表達，且能夠調(diào)節(jié)靶基因HMMR的表達[19]；此外，王冉冉等[20]研究發(fā)現(xiàn)HMMR-AS1在上皮性卵巢癌中通過介導(dǎo)EMT的發(fā)生降低卵巢癌細胞對化療藥物敏感性，并促進卵巢癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，HMMRAS1在子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織中檢測發(fā)現(xiàn)HMMRAS1在子宮內(nèi)膜癌中高表達，且其高表達與其靶基因HMMR呈正相關(guān)。通過化療敏感性實驗發(fā)現(xiàn)過表達HMMR-AS1能夠促進子宮內(nèi)膜癌細胞系增殖，并降低其對化療藥物順鉑及氟尿嘧啶的敏感性，進而導(dǎo)致其對順鉑和氟尿嘧啶產(chǎn)生耐藥。這與王冉冉等[20]在上皮性卵巢癌中的研究相符，均表現(xiàn)為促癌作用，并能夠介導(dǎo)以上兩種腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。通過檢測過表達HMMR-AS1后細胞HMMR蛋白質(zhì)水平的變化發(fā)現(xiàn)HMMR蛋白質(zhì)水平升高，這與HMMR在惡性膠質(zhì)瘤中能夠促進化療耐藥的研究相符。

以上研究結(jié)果表明，HMMR-AS1在子宮內(nèi)膜癌中通過促進HMMR的表達降低子宮內(nèi)膜癌細胞對順鉑及氟尿嘧啶的敏感性，進而產(chǎn)生耐藥。但HMMR-AS1與HMMR之間相互作用，并介導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細胞耐藥的分子機制尚未能明確，筆者所在課題組后期將進一步研究并揭示其分子機制，為子宮內(nèi)膜癌化療耐藥提供新的科學(xué)依據(jù)。