缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作患者血清miR-23b-3p水平變化的比較研究

樊春荔，何燕娟(常州市第一人民醫(yī)院，江蘇常州 210002)

中風(fēng)是當(dāng)今世界危害人類(lèi)生命安全的重要因素。在中國(guó)，中風(fēng)已成為導(dǎo)致人類(lèi)死亡和殘疾的主要原因[1-2]。缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是卒中最常見(jiàn)的亞型，是由于機(jī)體動(dòng)脈硬化或血栓阻塞血管，繼而表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的突然發(fā)作。短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack,TIA)也被稱(chēng)為“小中風(fēng)”，其起源與IS相同，癥狀類(lèi)似，但持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短（一般不超過(guò)24h）[3]。目前，IS及TIA患者確診主要依靠神經(jīng)影像學(xué)技術(shù)，但此類(lèi)檢查對(duì)急性重癥患者動(dòng)態(tài)觀察有一定的局限性，而且難以鑒別早期IS和TIA及其他類(lèi)似疾病，故具有一定的局限性。現(xiàn)有的與缺血性腦損傷相關(guān)的臨床生化指標(biāo)特異性較低，缺乏足夠的預(yù)測(cè)能力。故急需一種新方法解決當(dāng)今臨床面臨的問(wèn)題。

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性高度保守的非編碼單鏈小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[4]。已有研究證實(shí)[5-6]，多種miRNAs可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，可能參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展。miRNAs與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，且在血清或血漿標(biāo)本中穩(wěn)定存在并能長(zhǎng)期超低溫儲(chǔ)存[7-8]。近年來(lái)，血清或血漿miRNAs作為診斷腦血管疾病的重要生物標(biāo)志物受到了廣泛關(guān)注。目前，有關(guān)IS患者及TIA患者血清miRNA表達(dá)變化及系統(tǒng)研究較少。本課題組前期低密度芯片分析顯示，IS患者血清miR-23b-3p的表達(dá)明顯上調(diào)。因此，探討IS和TIA患者的血清miR-23b-3p水平變化，評(píng)估血清miR-23b-3p水平與疾病發(fā)生的關(guān)系，可能為臨床IS和TIA患者的病情評(píng)估與判斷提供新的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究招募了2017年8月～2019年4月常州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的156例IS患者及71例TIA患者作為觀察組。IS患者通過(guò)頭顱電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography,CT)和磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)等技術(shù)確診，排除標(biāo)準(zhǔn)：①有出血性梗死史；②有外周動(dòng)脈阻塞性疾病；③有慢性肝腎疾病；④伴有原發(fā)性/轉(zhuǎn)移性腫瘤或其他惡性疾病者。通過(guò)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)對(duì)IS患者進(jìn)行分級(jí)，輕度(NIHSS＜6,n=65)、中度(6＜NIHSS＜13,n=74)及重度(NIHSS＞13,n=17)。TIA患者入選符合2009年AHA/ASA提出的TIA診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)頭顱CT或MRI證實(shí)有新發(fā)梗死病灶或有顱內(nèi)出血者；②伴有嚴(yán)重感染者；③伴有其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及嚴(yán)重的肝腎功能不全者；④有甲狀腺功能異常、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病及全身免疫性疾病的患者。健康對(duì)照組招募85例健康體檢者。兩組之間性別、年齡匹配，具有可比性。所有患者和對(duì)照組均自愿簽訂知情同意書(shū)，且得到倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 高速離心機(jī)購(gòu)自上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司，檢測(cè)儀器為美國(guó)Applied Biosystems公司7300qRT-PCR儀，美國(guó)貝克曼AU5800全自動(dòng)生化分析儀，TaqMan探針購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystem公司。血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)水平測(cè)定采用英國(guó)Randox公司試劑盒，高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平測(cè)定采用日本第一化學(xué)株式會(huì)社試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的采集與處理：采用真空采血管收集所有研究對(duì)象禁食12 h以上的靜脈血液標(biāo)本約3～5ml，IS患者及TIA患者均于入院時(shí)即刻采集，4℃下12 000 g離心5min去除血細(xì)胞收集血清，并將血清標(biāo)本置于-80℃冰箱保存。所有血液標(biāo)本均取得本人的知情同意，且得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3.2 血清miR-23b-3p水平測(cè)定：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative reverse-transcription PCR,qRTPCR)技術(shù)檢測(cè)血清miR-23b-3p水平，結(jié)果以循環(huán)值(threshold cycle，Ct)表示，miRNA表達(dá)量均采用相對(duì)定量法進(jìn)行計(jì)算，以MIR2911探針作為外參，待測(cè)樣本miRNA的相對(duì)變化倍數(shù)△Ct=△CtmiRNAs-△Ct外參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以Kolmogorov-Smirnov法檢驗(yàn)各組的分布特征。其中正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，偏態(tài)數(shù)據(jù)需經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后再行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用中位數(shù)(第25～75百分位數(shù))表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析，方差齊時(shí)組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane'sT2檢驗(yàn)。變量間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。ROC曲線(xiàn)分析計(jì)算血清miR-23b-3p判別疾病的曲線(xiàn)下面積(area under the curve,AUC)及 其95%置信區(qū)間(confidence interval,CI)。多元Logistic回歸分析計(jì)算各指標(biāo)對(duì)疾病預(yù)測(cè)的OR值和95% CI。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的基本臨床信息 對(duì)IS患者、TIA患者及對(duì)照組的基本信息及血清生化指標(biāo)進(jìn)行分析，見(jiàn)表1。結(jié)果顯示：三組研究對(duì)象間年齡（F=0.575,P=0.439）、性別(χ2=0.149,P=0.925)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組相比，IS及TIA患者的血清TG水平均顯著升高(IS:t=3.224,P=0.049;TIA:t=3.857,P=0.021)，HDL-C水平明顯 降低(IS:t=4.137,P＜0.001;TIA:t=5.481,P＜0.001)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 研究對(duì)象的臨床基本信息及血清生化指標(biāo)

2.2 IS患者和TIA患者血清miR-23b-3p水平 分析IS組、TIA組及對(duì)照組的血清miR-23b-3p水平，見(jiàn)圖1(A)。結(jié)果顯示：IS組(t=4.517,P＜0.001)及TIA患者組(t=2.728,P＜0.001)血清miR-23b-3p水平均顯著高于對(duì)照組，且IS組明顯高于TIA患者組(t=3.364,P=0.043)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析不同嚴(yán)重程度IS患者的miR-23b-3p表達(dá)量，見(jiàn)圖1(B)。結(jié)果顯示：重度IS組miR-23b-3p水平明顯高于中度IS組(t=1.212,P=0.034)和輕度IS組(t=4.931,P＜0.001)，中度IS組miR-23b-3p水平高于輕度IS組(t=2.199,P=0.009)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 IS患者和TIA患者血清miR-23b-3p水平

2.3 血清miR-23b-3p水平的臨床價(jià)值 相關(guān)性分析顯示，IS患者血清miR-23b-3p水平與NIHSS評(píng)分呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.453,P＜0.001)；與患者TC，TG等水平無(wú)顯著相關(guān)性。

ROC曲線(xiàn)分析顯示，血清miR-23b-3p區(qū)分IS患者與健康對(duì)照者的AUC為0.817(95%CI:0.762～0.873,P＜0.001)；區(qū)分TIA患者與健康對(duì)照者的AUC為0.789(95%CI:0.716～0.861,P＜0.001)。

進(jìn)一步多元Logistie回歸分析，以IS，TIA和健康對(duì)照組為獨(dú)立的三分類(lèi)變量。單因素分析顯示：以健康對(duì)照組作為參考類(lèi)別，血清高miR-23b-3p水平與IS及TIA的發(fā)生相關(guān)；以TIA患者組作為參考類(lèi)別，血清高miR-23b-3p水平仍與IS的發(fā)生相關(guān)。多因素分析顯示：以健康對(duì)照組作為參考類(lèi)別，在校正了年齡、性別、TC及TG水平的影響后，血清miR-23b-3p水平的升高與IS及TIA的發(fā)生仍相關(guān)；以TIA患者組作為參考類(lèi)別，血清高miR-23b-3p水平仍可區(qū)分IS的發(fā)生，見(jiàn)表2。

表2 血清miR-23b-3p對(duì)IS及TIA的預(yù)測(cè)與區(qū)分價(jià)值

3 討論

miRNAs的表達(dá)分布具有高度的組織和細(xì)胞特異性，且參與多種生物進(jìn)程與疾病發(fā)展[9]。目前，已發(fā)現(xiàn)多種miRNAs參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的起源與發(fā)展[6,10-12]。已有研究表明多種細(xì)胞可以主動(dòng)或被動(dòng)地釋放循環(huán)miRNAs[13]。多個(gè)研究小組已對(duì)IS患者循環(huán)miRNAs的表達(dá)模式進(jìn)行研究，強(qiáng)調(diào)了miRNAs介導(dǎo)的腦缺血調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，提示miRNAs可能成為IS檢測(cè)的潛在生物標(biāo)志物[14-15]。在前期研究中，我們通過(guò)低密度芯片技術(shù)篩選出血清miR-23b-3p，進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)其在IS患者和TIA患者中的特異性表達(dá)。經(jīng)過(guò)多種統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，IS患者和TIA患者血清miR-23b-3p表達(dá)水平顯著升高，提示miRNAs可能參與缺血性腦血管病的發(fā)生、發(fā)展。

有研究發(fā)現(xiàn)[16]，miR-23b-3p參與缺血缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其表達(dá)上調(diào)可減輕被誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)為miR-23b-3p參與缺血性腦損傷提供了支持，為進(jìn)一步研究其在缺血性腦血管病中的臨床意義提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，NIHSS評(píng)分越高的IS患者血清中miR-23b-3p水平升高越顯著。由此，我們推測(cè)血清miRNA的改變可能來(lái)源于大腦皮層或海馬區(qū)神經(jīng)元的缺氧/缺血損傷，IS患者血清miRNA水平的升高可能是加重神經(jīng)功能缺損的血清學(xué)反應(yīng)。

TIA是一種可逆的神經(jīng)功能障礙且無(wú)急性組織梗死的局灶性暫時(shí)性腦缺血發(fā)作，其臨床表現(xiàn)與IS早期非常相似。TIA患者后期中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)將顯著增高，通常將其作為中風(fēng)前兆。因此，有效預(yù)測(cè)TIA的發(fā)生，區(qū)分TIA和初級(jí)卒中，有助于早期預(yù)防卒中及其后遺癥的發(fā)生。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[17]嚙齒類(lèi)動(dòng)物短暫性大腦中動(dòng)脈阻塞后血液miRNAs表達(dá)顯著改變，提示循環(huán)miRNAs在腦缺血早期具有反應(yīng)性，可作為輕度腦缺血損傷的敏感指標(biāo)。然而，特異性miRNA血清水平變化在TIA患者中的潛在臨床應(yīng)用尚不清楚。在本研究中，TIA及IS患者血清miR-23b-3p水平均顯著升高(P＜0.001)，且IS患者組高于TIA患者組(P=0.043)；IS患者血清miR-23b-3p水平與NIHSS評(píng)分呈正相關(guān)(P＜0.001)。說(shuō)明高水平的血清miR-23b-3p可能有助于IS的危險(xiǎn)分層和TIA的早期鑒別，為疾病預(yù)測(cè)和鑒別診斷提供了新思路。由此可見(jiàn)，血清miR-23b-3p有望成為IS和TIA預(yù)測(cè)和鑒別的潛在生物標(biāo)志物，對(duì)評(píng)估TIA后神經(jīng)功能缺損的嚴(yán)重程度及隨后的卒中風(fēng)險(xiǎn)有重要意義。