尿干化學法和離心沉渣鏡檢法檢測穿刺羊水母體細胞污染的應用

林俊偉，章 鈞，侯紅瑛，葉燕綢，詹龍生，劉 城

（中山大學附屬第三醫院婦產科，廣州 510630）

產前診斷不斷發展在提高人口素質，減少出生缺陷方面意義重大，但現有研究發現羊水母體細胞污染（materall cell contamination，MCC）是影響產前診斷結果準確性的主要因素之一[1]。產前診斷羊膜腔穿刺有創性是導致羊水MCC主要原因，不同單位羊水穿刺MCC發生率差異較大，據相關報道羊水MCC發生可高達68%[2]，發生差異性跟穿刺者的經驗、手法以及孕婦個體情況等有一定相關。大部分母血污染羊水血性程度不明顯，即使是離心后的非血性污染的羊水樣本仍有存在MCC可能，需要進一步鑒別。目前鑒別MCC分子技術主要為熒光定量PCR（QF-PCR），基因芯片（CMA，SNP Array)等，現有技術對實驗室條件要求高，操作繁瑣，設備昂貴，報告周期長，本研究通過聯合使用尿干化學法和離心沉渣鏡檢法鑒定羊水MCC，尋找一種在報告周期、檢測成本、操作過程等方面都優于分子檢測技術的鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2019年6～10月孕16～24周在我院產檢孕婦30例，具備產前診斷指征，遵照知情同意原則，采集羊水與全血樣本。

1.2 儀器和試劑 儀器：移液器、1.5ml無菌離心管及無菌吸頭，15ml無菌尖底離心管，臺式高速離心機，旋渦振蕩器，干燥儀或金屬浴，尿干化學分析儀（羅氏u411），PCR擴增儀(9600美國ABI公司)。試劑：基因組DNA快速提取試劑盒，蛋白酶K，0.25g/dl胰酶，Buffer AL(德國Qiagen公司)，尿干化學試紙條（羅氏公司）。

1.3 方法

1.3.1 羊水與全血DNA提取：采集10 ml羊水標本2 500r/min離心10 min，收集沉淀，留取200 μl的細胞沉淀液,每份樣品中加入20μl的蛋白酶K,200μl的buffer AL震蕩混勻，金屬浴56℃孵育10min，DNA進行濃度純度檢測。取200μl全血同上操作提取DNA進行濃度檢測。

1.3.2 收集30例全血（200μl/份）與羊水（10ml/管）樣本提取DNA：結果按照10%母體DNA污染率換算出對應全血體積及與10ml羊水體積比，換算方式：A=B*10%/C，其中A為10ml羊水中10% 母體DNA污染的全血體積，B為10ml羊水DNA總量，C為每微升體積全血DNA濃度。根據10% MCC母血與羊水體積比建立分別為5%，10%，20%，30% MCC污染梯度模型。

1.3.3 通過尿干化學法及沉渣鏡檢法對模型白細胞進行檢測：尿干化學法嚴格按照相關操作規范及說明書進行操作，結果判讀：結果≥1+為陽性，“neg”為陰性；離心沉渣鏡檢:標本離心2 500/5min，分離去上清液，取沉渣0.2ml置于玻璃片上，顯微鏡下計數白細胞數（WBC），結果判讀：WBC≥1/HP為陽性，WBC=0/HP為陰性。

1.4 統計學分析 計數資料采用率（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

羊水MCC模型通過尿干化學法與離心沉渣鏡檢法聯合檢測，污染率為30%，20%時兩種方法檢出率均為100%，檢出率一致；污染率為10%和5%時尿干化學法檢出率分別為60%，16.67%；離心沉渣鏡檢法檢出率分別為100%，60%，兩種方法在污染率為10%與5%的檢出率差異均有統計學意義（χ2=11.915～15.000，均P＜0.01）。尿干化學法對20%以上母體DNA污染檢出率為100%，離心沉渣鏡檢法對10%以上母體DNA污染檢出率為100%，兩種方法檢出率與污染率呈正比關系，見表1。

表1 尿干化學法與沉渣鏡檢法檢測30例不同比例羊水MCC結果分析

3 討論

美國醫學遺傳學和基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）制定產前診斷樣本MCC的檢測規范，規范要求所有進行分子診斷和分子遺傳學檢測的產前標本都要常規進行MCC檢測，排除MCC的潛在影響，來確保檢測結果的準確性[3]。QF-PCR(熒光定量PCR)是目前鑒定MCC常用技術，但技術要求高，周期長且無法檢測低于10%母體DNA污染[4]。

羊水MCC是母體血細胞污染，主要是由于羊膜腔穿刺出血導致，通過快速檢測全血中白細胞可以判斷MCC存在。全血中性粒細胞占白細胞總數55%～70%[5]，尿干化學酯酶法是通過中性粒細胞破裂釋放特異性中性粒酯酶水解吲哚酚酯生成吲哚酚和有機酸引起試紙條顏色發生變化來反映樣本中中性粒細胞存在[6]，由于羊水沉淀胎兒成分無白細胞，當穿刺發生MCC時，羊水沉淀中存在母體白細胞污染，檢測羊水白細胞成分可提示MCC。本研究發現對于MCC大于20%時，尿干化學法與沉渣鏡檢法均做出陽性判斷，MCC低于20%時中性粒酯酶濃度降低，尿干化學法檢出率降低，MCC污染比例為10%時，尿干化學法在30例樣本中12例檢測結果為陰性，檢出率為60%，原因為隨著污染比例降低，中性粒酯酶濃度降低，當中性粒酯酶濃度低于檢測下限時檢測結果為陰性。離心沉渣鏡檢法對MCC大于10%羊水樣本檢出率為100%，但隨著污染比例降低每高倍鏡視野下白細胞數量減少，本研究在MCC比例為5%時發現有12例樣本鏡下盡管能看到紅細胞存在但視野下白細胞數為0/HP,結果劃分為陰性，增加計數在不同視野可發現個別白細胞，但由于檢出率低，因此對低于10%母體DNA污染的羊水該方法檢出率低。MCC濃度影響兩種方法的檢出率，兩者呈正相關，但對于MCC檢出率影響還有一些羊水本身因素干擾。

羊水中糖及蛋白可導致尿干化學法檢測結果偏低[7]，而中性粒細胞酯酶釋放需要中性粒細胞破裂為前提，新鮮羊水樣本中性粒酯酶濃度偏低影響尿干化學法檢出率，而沉渣鏡檢法在顯微鏡下觀察白細胞數量可更直觀地反映MCC情況；羊水pH一般在8.0～9.0，中性粒細胞在堿性環境中容易破裂[6]，當羊水樣本存放時間過長時白細胞數破裂增多，沉渣鏡檢法結果可偏低或出現假陰性，而中性粒細胞破裂會釋放出更多中性粒酯酶有助于提高尿干化學法檢測率。因此尿干化學法與沉渣鏡檢法聯合檢測可以提高羊水MCC檢出率。

一般情況下羊水MCC都會出現不同程度血性，高比例MCC根據血性外觀可以判斷存在污染，但并非所有高比例MCC羊水樣本都呈血性外觀。隱匿性絨毛膜羊膜炎一般無明顯臨床表現及監測手段，絨毛膜中性粒細胞增加形成一定梯度向羊膜腔移動[8]，羊膜腔穿刺時中性粒細胞或中性粒細胞酯酶混入羊水導致MCC比例增加，由于沒有紅細胞混入，羊水外觀無明顯血性。尿干化學法可以直接檢測中性粒細胞酯酶存在，因此當發生隱匿性絨毛膜羊膜炎導致羊水MCC時，尿干化學法能更好地做出陽性判斷。

綜上所述，尿干化學法與沉渣鏡檢法聯合檢測可以作為羊水MCC鑒定手段，相對分子技術可節約成本，提高產前診斷效率，縮短報告等待周期，緩解患者焦慮心情，減輕患者經濟負擔同時對隱匿性絨毛膜羊膜炎有提示作用。