新型冠狀病毒核酸、抗原和抗體聯合檢測的臨床價值討論

張 園，周澤奇，王志賢，粟 艷，肖 盟，徐英春，王 賀

（1.“侵襲性真菌病機制研究與精準診斷”北京市重點實驗室丹娜生物分中心，天津 300467；2.中國醫學科學院北京協和醫院檢驗科，北京100730；3.“侵襲性真菌病機制研究與精準診斷”北京市 重點實驗室（BZ0447），北京100730）

自2020年1月報道新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）在人與人之間傳播以來，早期識別新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）患者是所有疫情區的防控重點。截止5月底，全球200多個國家和地區累計確診500多萬人，近33萬人喪生。研究觀察SARSCoV-2無癥狀患者的比例約占40%[1-2]，加速了SARS-CoV-2在全球的迅速傳播，因此遏制該病毒面臨嚴峻挑戰。核酸和免疫學檢測在診斷中發揮重要作用，核酸、抗原和抗體聯合檢測可以顯著提高檢出率，在治療監測、病程轉歸和預后等方面發揮重要作用，本文將最新的研究進行總結，具體如下。

1 核酸檢測研究現狀

1.1 核酸檢測原理及機制 SARS-CoV-2的核酸檢測包括測序和靶標序列識別，靶標序列一般是指高度保守的ORF1ab基因、核衣殼蛋白N基因、包膜蛋白E基因和刺突糖蛋白S基因。S蛋白與宿主細胞表面的血管緊張素轉化酶2（angiotensin converting enzyme2,ACE2）受體結合致病[3]。依據《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南》SARS-CoV-2擴增位置常見于ORF1ab和N基因兩個靶標[4]。目前，同一份標本需滿足核酸檢測雙靶標陽性或重復檢測單靶標陽性，判定為陽性。核酸檢測陰性不能完全排除SARS-CoV-2感染，需結合臨床癥狀綜合判斷[5]。中國藥品監督管理局批準上市的核酸檢測方法有實時熒光PCR法、恒溫擴增芯片法、恒溫擴增實時熒光法等。

1.2 核酸檢測的臨床價值 新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第二版至第七版）核酸檢測是疑似病例確診依據之一，是出院標準的重要參考，也是早期病原學診斷方法，為疫情防控提供了有力保障。河南省疾病預防控制中心共納入6 714份病人樣本，確診病例1 200例，疑似病例2 178例，無癥狀感染者77例。確診病例呼吸道標本核酸陽性率63.10%，鼻拭子、痰液和咽拭子的核酸陽性率分別為50.80%，58.71%，65.21%。發病后1周、2周、3周、4周、5周及5周以上呼吸道樣本確診病例陽性率依次為89.03%，86.57%，52.30%，17.53%，17.69%和24.14%，發病后1周內核酸檢出率最高，表明核酸檢測是最有效的早期病原學檢測方法[6]。國家傳染病臨床研究中心的研究結論相似，在病程的1～7天敏感度為66.7%，在病程的8～14天敏感度為54.0%，在病程的15～39天敏感度為45.5%，提示在病程的中后期核酸檢出率降低[2]。還有研究在738例COVID-19家庭成員無癥狀醫學觀察中核酸陽性率高達9.49%。70例核酸檢測陽性無癥狀患者45.71%在30天內轉為確診，證明核酸檢測時病毒已侵入體內，未引起全身免疫性反應，已具有一定的傳染性[7]。核酸檢測有利于盡早發現無癥狀感染者，提前干預治療，避免或縮短病程，減輕患者癥狀，有助于疫情早期防控[8]。

1.3 核酸檢測的局限性 核酸檢測敏感度受病毒本身及采樣、處理、運輸、保存、受試者和試劑質量等影響，未完全滿足臨床需求[9]。①病毒感染時間的延長，機體進入免疫應答，抗體可中和病毒，病毒復制被抑制，產生假陰性。②核酸檢測樣本包括鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、糞便等[10-11]。下呼吸道標本如痰液、氣道抽取物或肺泡灌洗液更加準確。③核酸檢測操作復雜、耗時長、技術人員要求高、傳染風險大，不適宜用于疑似患者和密切接觸人群的快速篩查。迫切需要多元化的檢測方法，其中抗體檢測是首選。

2 抗體檢測的研究現狀

2.1 抗體檢測原理及機制 病毒入侵機體后作為免疫原被吞噬細胞吞噬，吞噬細胞呈遞抗原給T細胞，再由T細胞呈遞給B細胞產生特異性抗體。IgM是初次免疫應答最早出現的抗體，提示急性感染，親和力較低，持續時間短。IgG發揮保護作用是再次免疫應答的主要抗體，提示病情進入中后期或既往感染；持續時間長并且抗體滴度較高。抗體檢測可作為判斷病毒在不同時間窗的間接證據[12-13]，圖1為核酸、抗原和抗體檢測的時間窗。

圖1 核酸、抗原、抗體檢測的時間窗

理論上，特異性抗體通過免疫復合物的形式中和病毒，使病毒失活并清除，抗體濃度越高越好，但研究證實恰恰相反。復旦大學針對175例患者的血漿樣本研究發現總抗體滴度越高，患者病情越重[12]。武漢大學人民醫院研究證實IgG抗體和中性粒細胞與淋巴細胞的比值（NLR）對患者病情嚴重程度的預測及預后有關。NLR代表先天性免疫，而IgG代表后天獲得性免疫。研究發現IgG水平越高，NLR比值越高，患者病情越危重[14]。以上研究揭示特異性抗體的產生是把雙刃劍，既可以清除病毒，也可能促進病毒的復制，加重對機體的損害，可能是IgG抗體依賴性增強（antibody-dependent enhancement,ADE）起作用。通常，人體感染病毒，會產生中和抗體和非中和抗體。當體內中和抗體水平非常高，足以與病毒的關鍵蛋白結合阻斷病毒感染，則不產生ADE效應。當中和抗體的濃度不夠高，不能與病毒表面蛋白充分結合，可促進病毒與細胞的結合，有可能引發ADE效應[15-16]。

山東大學研究表明SARS-CoV-2可以在已產生特異性抗體的患者體內長期存在，1例患者病毒和抗體共存長達50天，另1例在觀察的66天內，一直沒有產生抗體，最終核酸檢測轉陰，這表明抗體并不是清除病毒的必要條件，有些患者在感染后可能并不產生抗體[17]。復旦大學研究對175例輕度癥狀康復者的血漿進行了篩選，發現這些患者中盡管病毒核酸檢測陽性，但30%的患者抗體滴度很低，有10例患者未能檢出抗體，即使出院后復查，也沒有檢測到，這些患者的康復更多是依靠T細胞免疫作用[18]。

2.2 抗體檢測的臨床價值 廣州呼吸健康研究院證實IgM和IgG抗體聯合檢測的敏感度高于單獨的IgM或IgG抗體檢測[13]。武漢大學人民醫院檢驗科對205例COVID-19患者進行抗體檢測，IgM和IgG敏感度分別為70.24%和96.10%，抗體聯合檢測敏感度提高[19]。

天津市疾病預防控制中心研究不同病程患者IgM和IgG的抗體水平，IgM抗體水平在病程早期和中期呈上升趨勢，在中期最高，后期IgM抗體水平呈下降趨勢。IgG抗體水平在病程早期、中期及后期呈逐漸升高的趨勢，尤其在病程的后期抗體水平最高，與早期相比呈4倍升高，這與機體免疫應答規律一致，IgM抗體先升高后降低，IgG抗體產生晚于IgM抗體，可較長時間高濃度存在。因此，如果要篩查出急性感染和復發感染患者，則需要核酸配合抗體檢測，這對疫情防控有十分重要的價值[20]。

2.3 抗體檢測的局限性 ①抗原選擇是否與SARSCoV或其亞屬冠狀病毒有交叉反應；②抗體檢測方法學所涉及的試劑盒陽性判斷值的設定要合理，一些處于陽性判斷值附近的弱陽性很可能是假陽性；③患者標本中存在導致免疫測定假陽性的內源性或外源性干擾物質的存在，內源性干擾物質一般包括類風濕因子（RF）、嗜異性抗體、補體、因使用鼠抗體治療或診斷誘導的抗鼠Ig抗體等。

3 抗原檢測的研究現狀

3.1 抗原檢測的原理及機制 抗原是指SARS-CoV-2病原體引發免疫反應的部分。SARS-CoV-2的N蛋白和S蛋白具有很強的抗原性，在誘導宿主免疫應答與發病機制中發揮重要作用。抗原可用作SARS-CoV-2檢測的抗原位點，類似于PCR檢測，抗原檢測可用于COVID-19早期病原體感染的直接證據。

3.2 抗原檢測局限性 ①抗原制備時間長。獲得特異度高、純度高、活性高的抗原需要數月時間，包括完成抗原重組表達、篩選、分離、純化、鑒定與制備等工藝流程。②抗原檢測試劑盒的開發需要獲得敏感度高、特異度高的抗體，該類抗體的選擇與制備有很多困難，需要數月乃至更長時間。③抗原檢測不像核酸檢測獲得較高的檢測靈敏度。④SARS-CoV-2 N蛋白與其它SARS-CoV N蛋白存在交叉反應的干憂。雖然有一些研發團隊在開發此類產品，因制備難度大、技術不夠成熟，尚未獲得臨床認可。抗原檢測方法有待進一步開發與優化，早日獲準上市。

4 聯合檢測優勢和結果判讀

WHO發布COVID-19疑似病例實驗室檢測指南中核酸檢測仍是金標準，血清學檢測可以輔助調查現有疫情暴發情況以及回顧性評價發病率或者疫情蔓延趨勢。當患者核酸檢測呈陰性，但有COVID-19流行病學史，血清學檢測可作為輔助診斷[21]。

深圳市疾病預防控制中心的研究結果證實第2周核酸已轉陰患者的抗體水平顯著高于核酸陽性患者的抗體水平，證明在病程早期高水平IgG抗體對病毒清除具有一定作用[22]。華中科技大學附屬同濟醫院的研究結果顯示COVID-19患者的IgM高峰時間為核酸檢測轉陰后第4天，隨后IgM水平下降；IgG水平在核酸陰性前4天就已升高至正常值約20倍，在核酸檢測轉陰后4天已達到高峰，隨后穩定在峰值。IgM和IgG抗體檢測可減少核酸檢測假陰性。湖南中醫藥大學研究結果核酸檢測轉陰后血清IgM抗體陽性率為52.9%，低于核酸檢測轉陰前IgM抗體陽性率88.2%[23]。

武漢大學人民醫院檢驗科研究證實抗體檢測可以彌補核酸檢測不足，19例具有臨床癥狀及CT影像學特征但核酸檢測陰性的臨床診斷COVID-19患者，16例IgM抗體檢測呈陽性，占84.21%；18例IgG抗體檢測呈陽性，占94.74%[19]。國家傳染病臨床研究中心的研究結果證實抗體聯合核酸檢測敏感性高，在病程的1～7天共94例，核酸檢測敏感性為66.7%，聯合檢測的敏感性為78.7%；在病程的8-14天共135例，核酸檢測敏感度為54.0%，聯合檢測的敏感度為97%；在病程的15～39天共90例，核酸檢測敏感度為45.5%，聯合檢測的敏感度為100%[2]。由此可見，在COVID-19患者病程的中后期，聯合檢測可顯著提高檢出率。

IgM和IgG抗體聯合檢測優劣勢在于：①可以彌補核酸檢測不足而顯著提高敏感度，尤其在臨床上有癥狀的患者或高風險人群，使用抗體檢測是非常有效的手段。②較核酸檢測更準確地判斷疾病的進程，抗體檢測是SARS-Cov2感染的間接證據，其中IgM呈陽性指示患者為急性感染；而IgG呈陽性指示患者為既往感染。③通過核酸及抗體聯合檢測可進行健康人群的流行病學調查，抗體檢測更適合在流行率高的人群進行，當人群流行率低，特別是顯著低于試劑的假陽性率，適用性顯著降低。

綜上所述，SARS-CoV-2核酸檢測是金標準,為早期檢測病原體的直接證據，抗體檢測是有效的輔助診斷，是核酸檢測的重要補充，為檢測病原體的間接證據，也是未來疫苗研發和應用判斷的重要指標。核酸、抗原和抗體檢測與臨床癥狀和CT影像學特征有機結合，在精準診療有十分重要的臨床價值。