一種國產(chǎn)新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的性能驗(yàn)證

宗曾艷，熊 丹，武 薇，湯花梅，陳大洋，豆小文，王萌萌，張秀明

(1.深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518001；2.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南 232001)

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）是自2019年12月暴發(fā)的新型傳染病毒，一種有包膜的RNA病毒，屬β冠狀病毒屬[1]。2020年1月中國研究團(tuán)隊(duì)通過高通量測序技術(shù)獲得了該病毒的全基因組序列，是由冠狀病毒開放閱讀框(ORFs)、核殼蛋白N基因和包膜蛋白E基因等基因組成[2-4]。感染患者常表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳和肺炎等癥狀[5]，嚴(yán)重者可快速進(jìn)展為膿毒血癥休克、代謝性酸中毒、凝血障礙等。2020年1月20日，SARS-CoV-2被納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，并采取甲類傳染病的防控措施進(jìn)行管理。國家衛(wèi)健委在發(fā)布的1～7個版本新冠病毒診療指南中均將qRTPCR核酸檢測作為SARS-CoV-2診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”[6]。

SARS-CoV-2基因組序列公布后，各企業(yè)積極開展SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒研發(fā)，并實(shí)際應(yīng)用到臨床實(shí)驗(yàn)室，但此次疫情來勢洶洶，臨床急需大量試劑盒對SARS-CoV-2進(jìn)行檢測，因此研發(fā)時未能用足夠臨床樣本確認(rèn)其性能，可能存在試劑優(yōu)化不充分、試劑批間差異大、“假陰性”等問題。為驗(yàn)證核酸檢測試劑盒是否滿足臨床SARS-CoV-2核酸檢測要求，本實(shí)驗(yàn)室對即將應(yīng)用于臨床檢測的一款試劑盒進(jìn)行性能驗(yàn)證。

本研究參照中國合格評定國家認(rèn)可委員會(CNAS)制定的CNAS-GL039《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》[7]和EP15-A3文件對深圳市梓健生物科技有限公司（下簡稱梓健）研發(fā)的SARSCoV-2試劑盒關(guān)鍵性能指標(biāo)進(jìn)行評估，以驗(yàn)證該試劑盒是否滿足本實(shí)驗(yàn)室檢測要求，為新發(fā)傳染病試劑盒快速研發(fā)提供評價參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 臨床陽性標(biāo)本：2020年1月29日～4月20日在本院初篩并由羅湖區(qū)疾病控制中心確診的15例新冠患者臨床檢測后剩余的咽拭子標(biāo)本。臨床陰性樣本：為健康人陰性樣本。以上所有樣本由專業(yè)人員按照《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南》采集并運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測，不能立即檢測的咽拭子-80℃保存。定值參考品和交叉反應(yīng)混合質(zhì)粒來源于梓健公司。干粉標(biāo)準(zhǔn)品來源于菁良基因科技有限公司（編號：GWCRPM001），該標(biāo)準(zhǔn)品包含新冠病毒ORF1ab部分區(qū)域序列，N基因和E基因全長序列。因?yàn)樵噭┖蠴RF1ab引物位置不在該標(biāo)準(zhǔn)品ORF1ab基因片段內(nèi)，因此該標(biāo)準(zhǔn)品只用于N基因檢出限驗(yàn)證。

1.2 試劑與儀器 SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒（深圳市梓健生物科技有限公司，以下簡稱梓健，批號：2020021101），核酸提取純化試劑盒（寧波海爾施基因科技有限公司，批號：REF1060167），NP968-C型核酸提取儀（天隆科技），ABI7500PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 反應(yīng)體系：該試劑盒使用ORF1ab和N基因作為檢測靶標(biāo)基因，人源性內(nèi)參基因作為內(nèi)標(biāo)，CY5通道采集熒光信號。結(jié)果判讀：根據(jù)說明書中循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)40和擴(kuò)增曲線進(jìn)行判讀。

1.3.2 陰陽性符合率：陰陽性符合率分別使用定值標(biāo)準(zhǔn)品及臨床樣本驗(yàn)證。20例SARS-CoV-2陽性樣本中包括15例陽性臨床樣本（編號P1～P15，N基因Ct值為27.93～37.00，ORF1ab基因Ct值為26.88～36.11）和5例定值參考品（R1:5×107copies/ml，R2：5×106copies/ml，R3：5×105copies/ml，R4：5×104copies/ml，R5：5×103copies/ml）；20例陰性樣本中包括15例健康人陰性臨床樣本和5例陰性定值參考品，分別統(tǒng)計(jì)陰、陽性符合率，若大于95%，則判斷該試劑盒一致性符合要求。

1.3.3 精密度驗(yàn)證：使用2例陽性臨床樣本（1例弱陽性和1例強(qiáng)陽性）驗(yàn)證，參考EP15-A3文件，陽性樣本每天重復(fù)檢測5次，連續(xù)檢測5天，記錄每次檢測結(jié)果，分別計(jì)算25個檢測結(jié)果各靶基因Ct值重復(fù)性（批內(nèi)不精密度）和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)（CV），若CV≤5%，則認(rèn)為該試劑盒不精密度符合要求。

1.3.4 檢出限驗(yàn)證：核酸提取時，使用300μl樣本，得到60μl核酸，則提取后的核酸濃度為提取前的5倍，用該核酸進(jìn)行檢出限驗(yàn)證，對應(yīng)濃度為5copies/μl。將含N基因1 200copies/管的標(biāo)準(zhǔn)品，使用12μl無RNase水溶解，得1 000copies/μl核酸溶液。再將溶液稀釋200倍，得5copies/μl濃度N基因溶液，重復(fù)檢測該溶液20次。計(jì)算N基因檢出率，若有19次以上結(jié)果為陽性，即檢出率≥95%，則廠家聲明的檢出限得到驗(yàn)證。

1.3.5 交叉反應(yīng)驗(yàn)證：使用與其感染部位相同或感染癥狀相似且常見的其它病原體，包括人副流感病毒1型（2.4×106copies/ml）、鼻病毒（3.2×106copies/ml）、冠 狀 病 毒HKU1（2.2×106copies/ml）、NL63（3.1×106copies/ml）、229E（5.2×106copies/ml）、OC43（3.7×106copies/ml）、MERS（2.9×106copies/ml）、SARS（2.6×106copies/ml）、甲型流感病毒（5.4×106copies/ml）和乙型流感病毒（2.5×106copies/ml），共10個質(zhì)粒混合（各30μl）進(jìn)行交叉反應(yīng)。混合質(zhì)粒分別加入至5例陰性樣本中（每孔2.5μl陰性樣本+2.5μl質(zhì)粒），每個樣本進(jìn)行3個復(fù)孔擴(kuò)增檢測，統(tǒng)計(jì)5例標(biāo)本結(jié)果，若5例樣本結(jié)果均不出現(xiàn)擴(kuò)增曲線或Ct值，則表明該試劑盒無非特異性擴(kuò)增。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用MicrosoftExcel 2019,SPPS 24.0和GraphPad Prism7.0 (GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA,USA) 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不精密度采用標(biāo)準(zhǔn)差（s）和變異系數(shù)（CV）表示，計(jì)數(shù)資料采用率（%）或均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 陰陽性符合率 20例樣本ORF1ab和N基因Ct值均＜37，判斷為陽性結(jié)果，陽性符合率100%，其中弱陽性臨床樣本（P13）N和ORF1ab基因Ct值分別為37和36.56，為陽性結(jié)果。陽性對照出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線情況下，20例陰性樣本均未檢測出Ct值及擴(kuò)增曲線，陰性符合率100%。見圖1。

圖1 5例陽性參考品和15例陽性樣本ORF1ab基因和N基因檢測Ct值

2.2 精密度 2例臨床陽性樣本ORF1ab基因和N基因重復(fù)性、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)總不精密度CV均＜5%，該試劑盒不精密度符合要求，25次結(jié)果Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差和CV見表1。

表1 2例臨床陽性樣本N基因、ORF1ab基因精密度

2.3 檢出限 廠家聲明的該試劑盒檢出限為1 000 copies/ml，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品核酸濃度為5copies/μl，在陽性質(zhì)控及20個樣本內(nèi)標(biāo)都出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線的情況下，N基因20次檢測均出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線，Ct值為35.45±0.88，均＜37，判斷為陽性，檢出率100%，廠家聲明的檢出限得到了驗(yàn)證，見圖2。

圖2 RT-PCR檢出限反應(yīng)擴(kuò)增曲線

圖3 RT-PCR交叉反應(yīng)擴(kuò)增曲線

2.4 交叉反應(yīng) 該試劑盒檢測5例加有人副流感病毒、鼻病毒、冠狀病毒HKU1，NL63，229E，OC43，MERS，SARS，甲型流感病毒和乙型流感病毒質(zhì)粒的陰性樣本，每個樣本3個復(fù)孔檢測，以試劑盒內(nèi)陽性質(zhì)控為對照。檢測結(jié)果見圖3，陽性對照和內(nèi)標(biāo)有明顯擴(kuò)增曲線，但陰性標(biāo)本N基因和ORF1ab未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線或Ct值，表明以上病毒間均不存在交叉反應(yīng)，該試劑盒具有特異性。

3 討論

此次暴發(fā)的新冠肺炎截至2020年5月17日，全球確診病例數(shù)4 525 497例，累計(jì)死亡307 395例。我國開展系列防控措施以來，SARS-CoV-2感染上升的趨勢得到一定程度的遏制，但是境外感染情況不容樂觀，不斷有境外輸入病例，因此，仍應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對SARS-CoV-2的早期檢測。截至目前，國家藥品監(jiān)督管理局已應(yīng)急審批了11個新冠核酸檢測試劑及6個抗體檢測試劑[8]。我國核酸試劑盒按三類醫(yī)療器械標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行管理，在投入臨床使用前，應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的評估與驗(yàn)證。因此本研究對實(shí)驗(yàn)室即將使用的梓健試劑盒性能進(jìn)行驗(yàn)證。該試劑盒選取ORF1ab和N基因作為檢測靶標(biāo)，符合衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南》[9]。通過對該試劑盒評價，判斷是否滿足本實(shí)驗(yàn)檢測要求，以期為生產(chǎn)廠家持續(xù)改進(jìn)試劑盒質(zhì)量提供參考依據(jù)。

之前郭元元[10]等使用1例弱陽性樣本平行比較了6種國產(chǎn)試劑盒性能，最終發(fā)現(xiàn)6種新冠試劑對該樣本的檢測能力有差異，并且各試劑的敏感度、重復(fù)性、特異度等有待提高。本實(shí)驗(yàn)室收集20例臨床樣本對7種新冠核酸試劑盒（達(dá)安、華大、圣湘、亞能、梓健等）的檢測結(jié)果陰、陽性符合率和檢出能力進(jìn)行了評估（數(shù)據(jù)待發(fā)表），結(jié)果表明梓健試劑盒陰、陽性符合率達(dá)100%，驗(yàn)證了其聲明的檢出限為1 000copies/ml，基于這樣的基礎(chǔ)上，本次研究對梓健試劑盒進(jìn)行了較全面評估。通過對10例定值參考品和30例臨床樣本檢測，結(jié)果顯示，陽性樣本的N基因和ORF1ab基因Ct值均＜37，且曲線明顯，陰性雙基因均未檢出，N基因和ORF1ab陰、陽性符合率達(dá)100%；2例陽性樣本N基因、ORF1ab基因重復(fù)性、實(shí)驗(yàn)室總不精密度CV均＜5%，滿足要求；該試劑盒聲明的檢出限為1 000copies/ml，使用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到該濃度附近進(jìn)行20次檢測，N基因結(jié)果均為陽性，陽性率100%，該檢出限與多數(shù)試劑盒檢出限相同，表明檢出限能滿足臨床基本需求。

已有報(bào)道表明有六種SARS-CoV-2病毒可以感染人類，包括冠狀病毒229E，OC43，NL63，HKU1，SARS和MERS，此次的新冠病毒是第七種人冠狀病毒，所有冠狀病毒在其基因組表達(dá)上都有相似之處，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物和探針時，引物探針可能識別不了不同種屬冠狀病毒導(dǎo)致交叉反應(yīng)，因此本研究使用10種與新冠病毒感染癥狀相似或具有相似基因序列的病毒質(zhì)粒對該試劑盒交叉反應(yīng)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明即使是較高濃度的人冠狀病毒229E（5.2×106copies/ml）和甲型流感病毒（5.4×106copies/ml）質(zhì)粒在5例新冠病毒陰性樣本中仍沒有任何擴(kuò)增曲線，沒有發(fā)生交叉反應(yīng)，表明該試劑盒特異度好。

本研究對梓健試劑盒的重復(fù)性、陰、陽性符合率、交叉反應(yīng)、檢出限等參數(shù)進(jìn)行了評價，結(jié)果表明該批號試劑盒性能良好，能滿足實(shí)驗(yàn)室新冠樣本篩查。但本研究僅對梓健試劑盒一個批號做了評價，不能反映整體試劑盒質(zhì)量，應(yīng)收集不同地區(qū)、不同來源臨床樣本，與其他多家試劑盒、多中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行結(jié)果比對，以便為實(shí)驗(yàn)室選擇合適的試劑盒提供參考。