干式時間分辨熒光免疫層析法檢測血清抗鏈球菌溶血素“O”的方法學性能驗證

王玲萍,許 中,陸茜瑩，陸仁偉,周 偉，劉 琴

(1.蘇州市相城區漕湖人民醫院檢驗科，江蘇蘇州215144；2.蘇州市立醫院東區檢驗科,江蘇蘇州 215001； 3.上海捷門生物技術有限公司，上海 201806）

抗鏈球菌溶血素O（antistreptolysin O，ASO）的定量檢測可作為臨床鏈球菌感染后引發變態反應性疾?。L濕熱、腎小球腎炎等）的輔助診斷指標[1]。傳統的ELISA法操作復雜且特異度和重復性不理想而應用甚少。免疫透射比濁法雖常用，但有靈敏度低，檢測范圍較窄。免疫散射速率法結果準確，但儀器試劑進口價格昂貴，基層單位尚難普及。國內近年推出的時間分辨熒光免疫層析法（time-resolved fluorescence immuno chromatography，TRFIC）相對而言其設備簡單，操作便利，同時又兼具較好的靈敏度和準確度，是一種較易推廣使用的方法學平臺。為評價其在臨床應用可行性，我們對熒光免疫層析法血清抗鏈球菌溶血素“O”檢測試劑盒進行了臨床實驗室方法學性能驗證，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2019年5月份門診及住院患者檢測ASO的血清樣本共61例，其中陽性標本33例，均由蘇州市立醫院東區提供。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 試劑：實驗所用ASO時間分辨熒光免疫層析法檢測試劑及相應的校準品和質控品均由上海捷門生物技術有限公司提供。對比試驗所用散射速率法試劑由美國貝克曼公司提供。

1.2.2 主要儀器：干式時間分辨熒光分析儀（FIT-1000）及配套ASO檢測試劑由上海捷門生物技術有限公司提供。美國貝克曼公司IMMAGE800特定蛋白測定儀。

1.3 方法

1.3.1 方法學原理：固相雙抗原夾心法免疫試驗，待測樣本中所含的ASO，首先與鏈球菌溶血素O(streptolysin O，SLO)-稀土離子螯合物熒光乳膠微球結合，通過層析分離作用被固定在硝酸纖維素膜上的SLO（T線）捕獲，T線熒光信號被配套儀器定量測定，熒光強度與樣本中ASO濃度呈正相關。

1.3.2 正確度評估試驗：選用生產廠商提供的低 (83.2IU/ml) 、中(136.0IU/ml)和高(269.0IU/ml)濃度ASO校準品。校準品復溶后連續測試3次。

1.3.3 精密度評估試驗：采用簡易精密度評估實驗。隨機測試ASO低、高兩個濃度的臨床血清樣品，每個濃度標本連續測定4天，每天重復3次，共測試l2次。

1.3.4 線性評估試驗：參考CLSI EP6-A[2]文件方案，將低濃度水平混合血清、高濃度水平混合血清，按照體積比制備成濃度分別為50，180，360，540，720和900IU/ml。每個樣本平行測試3次。

1.3.5 臨床樣本比對試驗：收集臨床樣本61例，分別使用貝克曼IMMAGE800散射速率法[參考方法 (X)]和熒光免疫層析法[實驗方法(Y)]進行檢測。

1.3.6 受試者工作曲線（ROC）測試評價：以臨床推薦使用的美國貝克曼公司IMMAGE800散射速率法檢測ASO作為參考標準，以該儀器檢測ASO≥116IU/ml為診斷陽性（Pos.），＜116IU/ml為陰性（Neg.），進行受試者工作曲線（ROC）測試評價。

1.4 統計學分析 使用EP Evaluator分析軟件進行統計學分析。采用Pearson相關系數 (r)和配對t檢驗分析兩種方法之間的差異，當r＞0.95時認為相關性好。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正確度評估結果 見表1。低、中、高3個濃度的ASO校準品相對偏倚分別為-1.24%，-0.99%及2.70%，均在行業標準所列相對偏倚范圍內。

表1 正確度評估試驗結果

2.2 精密度評估試驗結果 低(18.6IU/ml) 、高(226.0IU/ml)兩個濃度樣本的CV分別為8.32%和6.39%，均在廠商聲明范圍（≤10%）內。

2.3 線性評估試驗結果 見圖1。ASO濃度在46.37～868.13IU/ml時檢測呈線性，直線回歸方程為Y=0.958 8X-3.889，r2=0.998 5。線性范圍符合廠商聲明區間(50～800IU/ml)。

圖1 ASO線性試驗結果

2.4 臨床樣品比對試驗結果 見圖2。比對試驗按照EP Evaluator軟件中的兩種儀器 (方法) 比對模式進行。Deming回歸方程截距(intercept)和斜率(slope)分別為-6.51 (95%CI:-28.28～15.25)和1.256 (95%CI:1.154～1.359)，r為0.950 6，相關性良好。

2.5 受試者工作曲線（ROC）評價結果 FIA-1000熒光免疫層析法檢測ASO的ROC曲線見圖3。曲線下面積（AUC）為0.942，標準誤為0.03，最靠左上角的截割點即最佳臨床診斷Cutoff值為150.8IU/ml。以ASO≥150.8IU/ml為診斷Cutoff值，其靈敏度為90.9% （95% CI 76.4%～96.9%），特異度為89.3% （95% CI 72.8% ～96.3% ），陽性及陰性似然比分別為8.48和0.10，陽性及陰性預測值分別為90.9% 和89.3% ，有效性為90.2% 。

圖2 兩種ASO檢測方法臨床樣品比對結果

圖3 熒光免疫層析法檢測ASO的ROC曲線圖

3 討論

本研究結果顯示，時間分辨熒光免疫層析法測定ASO具有良好的正確度和精密度，在845IU/ml濃度范圍內線性良好，與免疫比濁法的線性范圍接近[3]。和參考方法相比也有較好的相關性。同時，本研究亦對確定該熒光免疫層析法的參考值范圍進行了初步嘗試，以ASO≥150.8IU/ml作為診斷的Cutoff值。但因觀察例數尚少，故在開展ASO熒光免疫層析法定量的臨床檢測時，還需進行實驗室的參考值調查。

方法學性能驗證數據表明，FIA-1000時間分辨熒光免疫層析法檢測ASO能滿足臨床常規檢測應用，但也應看到該熒光免疫法既要注意時間、溫度等影響因素，同時也需對溶血、黃疸、脂血進行干擾試驗。有文獻報道，在類風濕關節炎伴隨有鏈球菌感染時，ASO亦有輕度升高，有較好的診斷價值[4]。這些有待進一步的病例試驗和研究。

在臨床特種蛋白的檢測實踐中，ASO是一項不可或缺的常用指標，其檢測方法學近20多年的發展演變，經過了從定性乳膠凝集到定量的免疫比濁法的進展[5-6]，產生了為數不少的介紹和評價二者各自特點的文獻[7-10]。這些都是基于對經典的免疫復合物微粒的濃度檢測。目前，國內規模醫院均已使用進口免疫散射速率法來定量檢測ASO[11-12]。盡管臨床符合性較好，但因此類儀器設備昂貴，不少基層醫院仍在使用傳統的乳膠凝集法定性檢測ASO，影響了臨床診斷的準確性、及時性。FIA-1000時間分辨熒光免疫分析儀及配套試劑，使用一次性測試卡，采用了目前已廣泛應用的現代免疫熒光標記技術[13-14]，利用稀土元素銪的熒光效應，在機體本底熒光消退后實現免疫復合物熒光測定。在樣本處理和測試操作上實現了隨到隨做，操作簡單。報告結果時間耗時不超過30min，大大方便了病人，適于在各臨床醫療機構尤其是中小醫院開展。