原發(fā)性硬化性膽管炎動物模型的研究進展

劉雨蓓 林以寧（通訊作者）

（中國藥科大學中藥學院 江蘇 南京 210039）

原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）是一種慢性的膽汁淤積性肝臟疾病，以肝內(nèi)外膽管彌漫性炎癥和纖維化所致的多灶性膽管狹窄為主要特征，最終導致膽管阻塞、膽汁淤積性肝硬化、肝衰竭[1]?；颊咴谌魏文挲g段均可能發(fā)病，診斷時年齡多在30 ～40 歲，大部分患者同時合并炎癥性腸病，且膽管癌等惡性腫瘤發(fā)生風險顯著增加[2]。目前PSC 的發(fā)病機制尚不清楚，除了晚期肝移植外，缺乏有效的治療藥物，因此建立相應的動物模型對于深入研究PSC 具有重要意義。前期人們對膽汁淤積癥的認識主要依賴于對嚙齒類動物進行膽管結(jié)扎的實驗模型，近年來通過基因調(diào)控、化學誘導等方法，已建立了多種膽管損傷的動物模型。本文對PSC動物模型的研究進展進行綜述。

1.基因敲除方法

1.1 Mdr2 基因敲除

ABCB4 基因，又稱為多藥耐藥3 基因（MDR3），主要負責調(diào)節(jié)磷脂的轉(zhuǎn)運，其在小鼠的同源基因為Mdr2，是ATP 結(jié)合轉(zhuǎn)運體超家族成員之一。在生理條件下，膽道磷脂通過Mdr2進入膽汁，形成混合的磷脂膽汁酸膠束，從而保護膽管細胞免受膽汁酸誘導的損傷。當Mdr2 基因突變時，膽汁中磷脂分泌減少，游離非膠束膽汁酸的濃度增加，隨后會導致膽管上皮細胞損傷，膽管纖維化，最終形成硬化性膽管炎[3]。該模型的主要優(yōu)點是其重現(xiàn)性高，易于操作，為研究旨在調(diào)節(jié)膽汁分泌和成分的新型PSC治療策略提供了機會。Fickert 等[4]證明了24-去甲熊去氧膽酸（norUDCA）在Mdr2 敲除小鼠硬化性膽管炎的治療效果方面，優(yōu)于熊去氧膽酸（UDCA）。Fuchs C D 等[5]證明了膽汁酸螯合劑通過改變肝和膽道的膽汁酸成分，使其更具親水性，從而減輕Mdr2 敲除小鼠膽汁淤積性肝膽損傷。

1.2 鐵螯合酶基因敲除（fch/fch）

紅細胞生成性原卟啉病是一種遺傳性血紅蛋白合成疾病，由鐵螯合酶的一個等位基因突變引起。患者鐵螯合酶的活性降低，導致紅細胞和肝臟中疏水性原卟啉沉積，通過分泌進入膽汁并隨糞便排出體外。Tutois 等[6]建立了fch/fch 動物模型，造模小鼠出現(xiàn)皮膚病變、黃疸和嚴重的肝功能障礙，其明顯特征是肝臟、脾臟和腎臟中鐵螯合酶活性降低，膽汁中膽汁酸鹽和原卟啉的濃度升高，形成的細胞毒性膽汁可通過損傷膽管上皮而導致膽道纖維化，這與Mdr2 敲除小鼠病理情況類似，鐵螯合酶缺陷的小鼠在3 個月內(nèi)會發(fā)生嚴重的肝纖維化并發(fā)展為肝硬化。

1.3 CFTR 基因敲除

囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)體（CFTR）是ATP 結(jié)合轉(zhuǎn)運體超家族成員之一，在肝膽系統(tǒng)中CFTR 位于膽管和膽囊上皮細胞內(nèi)膜頂端，其功能障礙可導致膽小管內(nèi)的氯離子分泌減少，膽汁黏稠和酸化，有毒膽汁酸積蓄，濃縮分泌物的形成會引發(fā)肝內(nèi)膽管阻塞和膽汁淤積。肝細胞和膽管細胞受損，單核細胞趨化因子釋放并作用于肝星狀細胞，同時膽管上皮細胞釋放細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子β，最終導致膽管增生，肝纖維化[7]。Durie P R 等[8]建立了Cftr-/-動物模型，模型組小鼠表現(xiàn)為進行性肝病，并伴有局灶性膽管炎、濃縮分泌物和膽管增生，長期可發(fā)展為肝硬化。

2.化學誘導方法

2.1 用DDC 喂養(yǎng)小鼠模型

DDC（3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫-2,4,6-三甲基吡啶）是一種誘導慢性肝炎的致毒劑，是經(jīng)典的化學染毒造模方法，DDC 給藥可刺激卟啉分泌，導致小膽管內(nèi)堵塞形成。其病理表現(xiàn)具有人類PSC 的幾個關(guān)鍵特征，如膽管周圍纖維組織增生，呈同心圓性洋蔥皮樣纖維化，匯管區(qū)炎癥以及節(jié)段性膽管梗阻[9]。Fickert 等[10]采用0.1% DDC 飲食喂養(yǎng)雄性白化病小鼠，4 周實驗后小鼠血清生化指標顯著升高，谷胱甘肽排泄減少，出現(xiàn)膽管阻塞。8周后小鼠膽道卟啉分泌增加，DDC誘導骨橋蛋白的表達，提示小鼠膽管損傷和纖維化。林韓特等[11]研究非諾貝特對DDC誘導PSC小鼠的預防作用及機制，實驗中模型組小鼠肝腫脹淤血，膽汁淤積顏色深；肝組織內(nèi)大面積細胞染色加深，呈嗜酸性病變，膽管周圍可見大量炎癥細胞浸潤，肝細胞局灶性壞死，提示DDC誘導PSC 模型成功。該模型發(fā)展緩慢，成本較低，對于研究外源性因素誘導的慢性膽管病機制很有價值。

2.2 用TNBS 喂養(yǎng)大鼠模型

TNBS（2，4，6-三硝基苯磺酸）作為半抗原引起細胞介導的免疫反應，與腸上皮細胞膜蛋白的賴氨酸基團有很強的親和力[12]。自90 年代初以來，TNBS 被認為是腸透壁炎癥的有效誘導因子，被用作克羅恩病的模型。后來研究發(fā)現(xiàn)[13]在大鼠中單次注射TNBS 可導致血清膽汁淤積指數(shù)（堿性磷酸酶和總膽紅素）顯著升高，并使炎性細胞浸潤門管區(qū)和膽管周圍，提示膽管周炎。TNBS 模型顯示一些特性與PSC 一致，包括膽管不規(guī)則，肝內(nèi)外膽管彌漫性局灶性結(jié)構(gòu)，導管增生和纖維化，由巨噬細胞和T淋巴細胞引起的單核細胞浸潤。該模型的一個主要限制是由并發(fā)癥引起的高死亡率。

2.3 用LCA 喂養(yǎng)小鼠模型

石膽酸（LCA）是一種單羥基膽汁酸，具有肝毒性，其誘導膽汁淤積可用多種機制來解釋，包括短時間內(nèi)給予大量LCA 會影響肝細胞膜的通透性，引發(fā)炎癥反應；以及LCA 的低溶解度所導致膽管中結(jié)晶栓的形成。Fickert 等[14]證明了給小鼠喂食疏水性LCA可在幾天內(nèi)誘導膽管炎的發(fā)生。組織學上表現(xiàn)為，肝細胞水腫，中性粒細胞浸潤，局部膽管阻塞和導管周纖維化。由于動物在長期內(nèi)不能耐受這種飲食，該模型不適合研究膽道損傷的慢性演變。

3.其他模型

PSC 的一個獨特臨床特征是它與炎癥性腸?。↖BD）的關(guān)系，主要是潰瘍性結(jié)腸炎，二者之間的聯(lián)系引起了人們對腸道菌群的關(guān)注。早期理論認為腸道微生物群在腸炎的病因中起著核心作用，也可能成為PSC 的發(fā)病機制之一，腸道細菌產(chǎn)生的毒性物質(zhì)可能會促進膽道的炎癥。Yamada S 等[15]對結(jié)腸炎大鼠的直腸灌注大腸桿菌趨化性多肽，經(jīng)直腸給藥幾天后，可見門管區(qū)明顯炎癥，肝細胞輕度壞死，誘導膽管炎的發(fā)生。該模型主要是淋巴細胞對小膽管的浸潤，提示大腸桿菌產(chǎn)生的趨化多肽在小膽管炎的發(fā)病機制中可能有重要作用。

4.結(jié)語

PSC 的病理過程是漸進的，絕大多數(shù)患者都是從膽管纖維化逐漸演變?yōu)楦斡不罱K發(fā)展為末期肝病。目前尚無有效的治療藥物，動物模型的建立為研究其發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)，為藥物研發(fā)創(chuàng)造了更多可能性。無論是基因修飾型還是化學誘導型動物模型，均和人類PSC 在組織學和免疫學上有很多相似之處，但是動物模型本身具有局限性，不可避免會出現(xiàn)疾病以外的并發(fā)癥。不同模型各有優(yōu)劣，在具體實驗中應根據(jù)不同的研究目的來選擇適當?shù)哪Ｐ?。對于PSC 動物模型還有待進一步研究，建立一個成本低、重現(xiàn)性好、操作簡單的實驗模型是研究人員追求的目標。