蛹草擬青霉FY1421培養物對南美白對蝦生長性能、血液生化指標和免疫功能的影響

劉曉紅，黃欽耿，梁 玲，趙 穎，唐謝芳，蔣順進，黃煒乾，吳松剛

(1.遼東學院農學院， 遼寧 丹東 118003；2.廣東容大生物股份有限公司， 廣東 清遠 511500；3.福建師范大學工業微生物教育部工程研究中心， 福建 福州 350107)

飼用抗生素在動物促生長、提高飼料報酬等方面具有顯著的效果[1]。但隨著抗生素作為動物促生長劑在飼料中的廣泛使用，其弊端正日益凸現，如導致動物胃腸道菌群失調、免疫刺激、廣泛耐藥性和藥物殘留等，也引發了一系列公共安全、環境保護和食品安全方面的問題[2-3]。2020年，中國正式進入“無抗養殖”新時代，飼料端全面禁抗，飼用抗生素替代品研究受到廣泛關注，如何開發尋找無毒、高效、不產生耐藥性的綠色安全飼料添加劑已成為動物營養領域熱點之一。

蛹蟲草在中國、韓國和日本已長期用作營養和保健食品，具有多種重要的生理活性[4]。蛹蟲草作為一種廣為人知的藥食用真菌之一，在分類學上隸屬于真菌界Fungi、子囊菌門Ascomycota、糞殼菌綱Sordariomycetes、肉座菌亞綱Hypocreomycetidae、肉座菌目Hypocreales、蟲草科Cordycipitaceae、蟲草屬Cordyceps[5]。目前，蛹蟲草已經進入我國新資源食品和新食品原料目錄，是國家認定的健康食品來源，其無性型菌株-蛹草擬青霉作為寄生于鱗翅目昆蟲蛹體的昆蟲病原菌，正是其廣泛的藥理活性成分的主要來源[6]。蟲草素作為蛹蟲草的標志性活性成分，國內外研究都顯示其具有非常好的抗病毒、炎癥修復以及免疫調節的功能[7]。此外，蛹草擬青霉代謝產生的其他活性物質，如蟲草多糖、蟲草酸、腺苷、甾醇類、超氧化物歧化酶(SOD)等，也展現非常廣泛的生理與藥理功能。Koh等[8]發現蟲草菌絲體的熱水浸提物用作抗生素生長促進劑替代品，能夠提高肉雞生長性能和免疫機能，改善動物腸道微生物組成；Han等[9]研究結果顯示，添加1 g·kg-1蛹草菌絲體及其代謝產物(蟲草素含量約為5.09 mg·g-1)顯著增加肉仔雞日增重，對肉仔雞的生長性能具有積極影響；Cheng等[10]在斷奶仔豬中添加1 000 μg·kg-1的蟲草素含量約為5.0 mg·g-1的蛹草擬青霉菌絲體及其代謝產物，可促進仔豬的生長性能和細胞介導的免疫力，有助于降低仔豬斷奶生理和免疫應激。不僅僅菌絲體，Waewagee等[11]采用蛹蟲草培育的基座(蟲草素含量約為3.63 mg·kg-1)，在育肥豬日糧中添加2.0 g·kg-1的蛹蟲草培養基座可顯著提高豬的生長性能，增強其免疫球蛋白分泌和抗氧化能力，同時降低生長豬的白細胞百分比，膽固醇和丙二醛濃度，而不損害肝功能。

因此，蛹草擬青霉及其代謝產物作為功能性飼料添加劑，被證明是動物生產中有效的營養調節素，能夠有效增強細胞活力，幫助機體建立免疫防線，從而提高免疫力，不僅可以改善動物健康，還可以減少藥物使用，改善腸道生態。本研究正是基于蛹蟲草豐富的生理和藥理功能，以特異型高產蟲草素蛹草擬青霉菌株FY1421(paecilomycesmilitarisFY1421)為基礎，通過發酵獲得富含蟲草活性成分的蛹草擬青霉培養物，評估其作為飼料添加劑對南美白對蝦生長性能及免疫能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蛹草擬青霉FY1421(paecilomycesmilitarisFY1421)菌種由遼東學院蟲草研究所提供，保藏編號為CCTCC NO：M2016220。南美白對蝦由福清宏峰泰水產養殖公司提供。南美白對蝦0、1號飼料由福建大昌生物科技實業有限公司提供。其中0號飼料為對蝦幼蝦飼料：秘魯魚粉37%、白魚粉18%、烏賊膏4%、大豆磷脂6%、發酵豆粕14%、蝦肉粉7%、海藻粉2.5%、次粉6.5%、小麥面筋粉5.2%、食鹽0.4%、預混料4%；1號飼料為對蝦中成蝦飼料：智利魚粉30%、國產魚粉8%、烏賊膏4%、發酵豆粕18%、花生粕6%、蝦殼粉10%、大豆磷脂5%、小麥粉10.5%、魚油1.5%、磷酸二氫鈣2.6%、乳酸鈣0.4%、預混料4%。

1.2 蛹草擬青霉FY1421培養物的制備

將活化后的蛹草擬青霉菌塊接種到裝有150 mL馬鈴薯葡萄糖蛋白胨液體培養基(配方：馬鈴薯的浸汁200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨3 g·L-1)的20瓶三角瓶(250 mL)中，然后將其放置搖床振蕩培養，轉速為230 r·min-1、28℃恒溫培養5 d，制成種子液3 L。將3 L蛹草擬青霉種子液接種到50 L發酵罐，發酵罐裝30 L馬鈴薯葡萄糖蛋白胨培養基(配方：馬鈴薯的浸汁200 g·L-1、葡萄糖30 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1)，28℃，通氣量10～15 L·min-1，壓力0.1 MPa下發酵培養3 d。發酵結束后，加入0.25%(w/v)的輕質碳酸鈣，進風135℃，出風85℃進行低溫噴霧干燥，得到蛹草擬青霉FY1421培養物。參考(NY/T 2116-2012《蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定高效液相色譜法》)方法檢測其蟲草素含量，獲得的FY1421培養物蟲草素含量為5.2 g·kg-1。

1.3 試驗分組以及飼養管理

首先進行對蝦幼苗培育，將幼蝦苗投放于5 m×3 m×1.5 m的水池中培養，水的鹽度為6‰，24 h充氣，水溫在24～29℃，初始只投放0號飼料，投餌量為蝦苗總重量的10%，分上下午投喂，每日投餌量增加10%。投喂20 d后，開始選擇健康、大小均勻的南美白對蝦，進行1號飼料喂養試驗。喂養試驗采用循環水機(福建省寧德市金鼎海洋水產研究所，GBL-800YZ-200型)，設試驗組與對照組，每組3個平行，每組各投放100尾，飼養于120 cm×80 cm×60 cm的圓形水族箱。試驗組以0.05%添加蛹草擬青霉FY1421培養物，添加劑加水與飼料充分混勻，對照組只投喂基礎飼料。投餌量為該水箱內蝦苗總重量的10%，分上下午投喂，每日投餌量增加10%。每日中午利用循環水泵吸出池底的殘餌和糞便，每周對水箱內添加新鮮的0.6%海水，試驗期間水鹽度保持于0.4%～0.7%，水溫為23～30℃，24 h充氣，飼養30 d后，測定相關指標。

1.4 南美白對蝦生長指標的測定

試驗開始測量每組蝦的總重量，結束時分別測量每尾蝦的體重，同樣測量每組蝦的初始長度，結束時分別測量每尾蝦的長度，去頭剝殼取肌肉。按以下公式分別計算增重率、增長率、成活率、出肉率和飼料系數：

增重率=(末體重-初始體重)/初始體重×100%；

增長率=(末長度-初始長度)/初始長度×100%；

成活率=末尾數/初始尾數×100%；

出肉率=肌肉重/末體重×100%；

餌料系數=(末體重-初體重)/總喂食的飼料量×100%。

1.5 南美白對蝦免疫指標的測定

首先用10 mL的注射器從對蝦背部的圍心腔中吸取血液，注入到1.5 mL離心管中，冰浴，4℃，12 000 r·min-1，10 min，取上清即為藍色的對蝦血清，-80℃冷凍保存備用。分別測定血清中溶菌酶、酚氧化酶。

溶菌酶活力的測定：用0.1 mol·L-1，pH=6.4的磷酸鉀鹽緩沖液溶解溶壁微球菌(Micrococcuslysoleiklicus)的凍干菌粉，將其配制成OD570nm約為0.3的懸液。取0.6 mL事先冰浴好的該懸液，加入10 L血清混勻，馬上測量其吸光值，此時為A0，然后將混勻液放入37℃水浴30 min，取出后立即置于冰浴中10 min終止反應，此時測量其吸光值為A末，溶菌酶活力UL按以下公式計算：UL=(A0-A末)/A末。

酚氧化酶活力的測定：以左旋多巴為底物，將1 mL的0.1 mol·L-1、pH=6.0的磷酸鉀鹽緩沖液與30 L的0.01 mol·L-1左旋多巴以及30 L的血清在室溫下混勻后，用酶標儀，每間隔2 min讀取在490 nm的吸光值，讀取1 h，以試驗條件下每分鐘增加0.001定義為一個酶活力單位。

肝胰腺中的堿性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活力測定采用南京建成生物工程研究所測定試劑盒。

1.6 南美白對蝦抗氧化指標的測定

肝胰腺中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)的測定采用南京建成生物工程研究所測定試劑盒。采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定肌肉中的丙二醛(MDA)，具體參照南京建成生物工程研究所測定試劑盒。

2 結果與分析

2.1 蛹草擬青霉培養物對南美白對蝦生長指標的影響

南美白對蝦的增重率、增長率、出肉率、成活率、餌料系數見表1。經單因素方差分析(SPSS 18.0)，結果顯示，添加0.05%蟲草素含量5.1 g·kg-1的蛹草擬青霉FY1421培養物作為飼料添加劑能夠有效改善南美白對蝦的生長性能。與對照組相比，試驗組的增重率提高34.0%，差異顯著(P<0.05)，增長率和出肉率也有改善的趨勢(P>0.05)。值得關注的是，添加0.05%的蛹蟲草擬青霉還能夠顯著提高個體成活率(成活率提高24.8%，P<0.05)，減少飼料投入(餌料系數降低9.8%)。

表1 南美白對蝦的生長指標

2.2 蛹草擬青霉培養物對南美白對蝦免疫指標的影響

蛹草擬青霉培養物作為添加劑對南美白對蝦血清中的溶菌酶、酚氧化酶活力，肝胰腺中的堿性、酸性磷酸酶活力的影響見表2。

溶菌酶、酚氧化酶、堿性及酸性磷酸酶都是甲殼動物重要的非特異性免疫酶類，也是其天然免疫的重要組成部分，在病原的防御與清除中發揮著重要作用，其活力水平一定程度上也反映了機體免疫功能的強弱。由表2可見，試驗組對蝦血清中的酚氧化酶、肝胰腺中堿性磷酸酶活力均顯著高于對照組(P<0.05)，分別提高34.0%和19.8%。溶菌酶活力和酸性磷酸酶活力也較對照組有改善，但差異不顯著(P>0.05)。體現了蛹草擬青霉培養物的添加能夠有效改善和促進磷酸酶活性，加速血液中磷酸基團的轉移和代謝，提高血液的解毒能力，同時能夠基于改善酚氧化酶和溶菌酶的活力增強對蝦的防疫與識別體系，提高免疫力。

表2 南美白對蝦的免疫指標

2.3 蛹草擬青霉培養物對南美白對蝦抗氧化指標的影響

肝胰腺中的超氧化物歧化酶以及過氧化物酶、過氧化氫酶的測定結果見表3。經單因素方差分析，結果顯示，添加蛹草擬青霉培養物的試驗組超氧化物歧化酶和過氧化物酶活力顯著高于對照組(P<0.05)，其中超氧化物歧化酶的活力極顯著高于對照組(P<0.01)，體現了較好的肝胰腺細胞的抗氧化活性；試驗組過氧化氫酶活力雖較對照組有改善，但差異并不顯著。另外，丙二醛作為組織細胞脂質自由基的降解產物，其含量間接反映組織細胞的過氧化程度，蛹草擬青霉培養物的添加明顯降低丙二醛含量(P<0.05)，展現了較好抗氧化機能，提高了對蝦的生長質量。

表3 南美白對蝦的抗氧化能力

3 結論與討論

自抗生素被發現有利于畜禽的生長發育，其為實現畜牧業快速發展做出了巨大貢獻[12]。養殖業一直采用抗生素作為生長促進劑來預防腸道疾病，但長期高劑量、多品種的添加造成耐藥菌株產生、藥品殘留、生態污染等問題[13]，也引發了系列的社會問題。2020年7月1日，中國正式禁止各類促生長抗生素在飼料中的添加，“無抗飼料”正式落地。2020年恰逢飼料禁抗元年，抗生素替代品的研發及應用案列也層出不窮，效果不一。鑒于飼用促生長抗生素的主要作用對象為微生物，作用場所也主要在動物腸道，所以飼用抗生素替代品的研發策略方面，動物腸道健康最受關注，通過維護腸道微生態平衡和提高腸道免疫來促進動物生長和保障動物腸道健康已經成為“后抗生素時代”健康養殖的行業共識。而通過活性營養調節素的形式增強動物免疫力，維護腸道免疫系統正常，允許動物自然防御疾病，使動物機體從根本上對病原形成強有力的抵抗，這無疑是健康養殖的核心。

蛹草擬青霉作為蛹蟲草的無性型，其菌體及代謝產物具備蛹蟲草子實體一致的蟲草活性成分，甚至某些成分含量能夠通過發酵控制而高效積累。研究表明，蟲草活性成分具有顯著地提高巨噬細胞的吞噬能力，激活非特異性免疫，抑菌、抗病毒、抗氧化等功能[14-16]，含有蟲草活性物質的飼料添加劑應用于動物飼料中，能夠提高飼料利用效率和生產性能，增強動物免疫功能和改善動物產品品質[17]。本研究以南美白對蝦為研究對象，通過制備富含蟲草素的蛹草擬青霉FY1421培養物，并以此作為飼料添加劑考察其對對蝦生長的影響。結果顯示，與對照組相比，添加0.05%蛹草擬青霉培養物能夠有效改善南美白對蝦的生長性能，增重較多(P<0.05)，而且個體成活率較對照組顯著改善(P<0.05)，餌料系數也降低了9.8%。其生長性能的改善不僅體現在個體數據上，在血液免疫指標方面，包括溶菌酶、酚氧化酶、堿性磷酸酶都有顯著增高(P<0.05)，酸性磷酸酶也有改善(P>0.05)，說明蛹草擬青霉培養物能激活南美白對蝦的免疫系統，改善對蝦的健康狀況。另外，抗氧化指標，包括肝胰腺中的超氧化物歧化酶和過氧化物酶均顯著高于對照組(P<0.05)，其中超氧化物歧化酶的活力較對照達到極顯著水平(P<0.01)，過氧化氫酶活性雖差異不顯著，但其活性也得到明顯改善。在過氧化代謝產物丙二醛的含量方面，試驗組也較對照組顯著降低，間接印證了蛹草擬青霉培養物突出的抗氧化活性。整體而言，蛹草擬青霉培養物可用于改善南美白對蝦的生長性能和健康狀況，也展示了將具有特殊蟲草活性營養調節素的蛹草擬青霉代謝產物作為對蝦飼料添加劑，可極大提高對蝦的生長指標，增強對蝦免疫和抗氧化能力，提高對蝦生存和抗病能力，為禁抗后的健康養殖提供了新選擇，也為蟲草屬真菌資源的利用提供新方向。