過氧化氫及類芬頓試劑對(duì)土壤碳、氮和微生物的影響①

周 洋，鄧亞梅，朱鳳曉，趙廣超，方國(guó)東*，王榮富，周東美

過氧化氫及類芬頓試劑對(duì)土壤碳、氮和微生物的影響①

周 洋1,2，鄧亞梅2, 3，朱鳳曉2，趙廣超1*，方國(guó)東2*，王榮富3,4，周東美2

(1 安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，安徽蕪湖 241002；2 中國(guó)科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京土壤研究所)，南京 210008；3安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036；4 安徽外國(guó)語(yǔ)學(xué)院國(guó)際旅游學(xué)院，合肥 231201)

基于過氧化氫(H2O2)的芬頓或類芬頓試劑被廣泛應(yīng)用于有機(jī)污染土壤的修復(fù)，但其對(duì)土壤基本性質(zhì)及微生物群落的影響研究較少。本文以H2O2和不同的芬頓體系為研究對(duì)象，系統(tǒng)考察了H2O2、V2O3/H2O2、檸檬酸鐵/H2O2體系對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮及微生物的影響。結(jié)果表明：H2O2在土壤中快速被分解，同時(shí)伴隨著土壤有機(jī)質(zhì)含量的顯著下降和銨態(tài)氮含量的顯著升高，土壤硝態(tài)氮含量變化不明顯。高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，H2O2和芬頓試劑顯著降低了土壤微生物的多樣性。

H2O2；類芬頓；土壤性質(zhì)；微生物多樣性；群落結(jié)構(gòu)

土壤作為生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，是人類賴以生存的主要資源之一，也是生物地球化學(xué)循環(huán)的物質(zhì)儲(chǔ)存庫(kù)。土壤有機(jī)質(zhì)是土壤中各種含碳有機(jī)化合物的總稱，它與礦物質(zhì)一起構(gòu)成土壤的固相部分。土壤有機(jī)質(zhì)是衡量土壤肥力的重要指標(biāo)，對(duì)作物生長(zhǎng)、土壤中的物質(zhì)循環(huán)和代謝具有十分重要的作用[1]。土壤微生物是土壤具有生命力的重要部分，土壤中細(xì)菌最多，放線菌其次，真菌再次之，藻類、原生動(dòng)物和微型動(dòng)物等由多到少依次排列。它們?cè)谕寥佬纬珊桶l(fā)育過程中起重要作用，同時(shí)，它們也是使土壤有機(jī)污染物降解的動(dòng)力[2-3]。因此，土壤微生物群體是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量和健康狀況的重要指標(biāo)之一。近些年，隨著我國(guó)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整及城市化進(jìn)程的加快，全國(guó)大中城市都實(shí)施了“退二進(jìn)三”、“退城進(jìn)園”的政策，大批涉及化工、冶金、石油、交通運(yùn)輸、輕工等行業(yè)的污染企業(yè)先后搬遷或關(guān)閉。2014年，《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，我國(guó)總體的土壤環(huán)境質(zhì)量不容樂觀，土壤污染總的點(diǎn)位超標(biāo)率為16.1%，重污染企業(yè)用地的點(diǎn)位超標(biāo)率為36.3%。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前國(guó)內(nèi)約有幾十萬(wàn)個(gè)污染場(chǎng)地。政府或業(yè)主對(duì)這些土壤進(jìn)行再利用時(shí)，必須進(jìn)行前期的修復(fù)[4]。基于H2O2或芬頓(Fenton)試劑的化學(xué)氧化技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于場(chǎng)地有機(jī)污染土壤的修復(fù)。芬頓試劑法主要是由亞鐵離子(Fe2+)和H2O2發(fā)生反應(yīng)迅速生成羥基自由基(·OH)來實(shí)現(xiàn)有機(jī)污染物的降解[5]：H2O2+ Fe2+→ ·OH + OH–+ Fe3+，·OH具有較高的氧化還原電勢(shì)(E0= 2.8 V)[6]，它不僅能夠有效無(wú)選擇性地快速降解土壤中的各種有機(jī)污染物，而且還能實(shí)現(xiàn)污染物的礦化[6-10]。宋剛練等[11]成功地將芬頓氧化法應(yīng)用于上海某工業(yè)場(chǎng)地的苯并[a]蒽和苯并[b]熒蒽修復(fù)中。裴曉哲和劉守清[12]研究了芬頓氧化法對(duì)敵百蟲污染土壤的修復(fù)效果，發(fā)現(xiàn)芬頓氧化法能夠快速高效地降解土壤中的污染物。Ojinnaka等[13]考察了pH對(duì)芬頓試劑氧化降解污染土壤中輕質(zhì)原油效率的影響，發(fā)現(xiàn)在酸性條件下芬頓試劑能夠高效降解土壤中的原油。

但以Fe2+/H2O2構(gòu)成的均相芬頓體系在實(shí)際的修復(fù)過程中存在一些問題，比如此反應(yīng)需要在強(qiáng)酸的條件下發(fā)揮作用(通常pH<3.0)、反應(yīng)速度不容易控制、自由基利用效率低等[14-16]。為了克服這些問題，檸檬酸通常作為Fe2+的絡(luò)合劑來控制Fe2+的反應(yīng)速率，從而大大提高自由基的利用率和污染物的修復(fù)效率[17]。另外，有研究表明，土壤中的一些礦物如鐵錳氧化物、釩礦物等也能催化分解H2O2產(chǎn)生自由基來降解污染物從而達(dá)到修復(fù)的目的[18-19]。因此，在實(shí)際場(chǎng)地的修復(fù)過程中，有一些企業(yè)嘗試在土壤中直接添加H2O2，利用土壤本身的礦物活化分解H2O2產(chǎn)生自由基來降解污染物。Lu等[20]研究了近中性pH條件下類芬頓試劑對(duì)石油污染土壤中碳?xì)浠衔锏慕到庑Ч?，發(fā)現(xiàn)當(dāng)H2O2與Fe2+摩爾比為200∶1且pH為7.0時(shí)達(dá)到最佳去除效果。Xu等[21]探究了不同改性芬頓試劑對(duì)土壤中原油選擇性降解的影響，發(fā)現(xiàn)分批次加入低濃度的H2O2對(duì)土壤中總石油烴降解效果最佳。江闖等[22]研究了類芬頓氧化法修復(fù)總石油烴類污染土壤的效果，發(fā)現(xiàn)此修復(fù)方法可行且高效。本課題前期研究也發(fā)現(xiàn)，五氧化二釩能夠高效活化H2O2產(chǎn)生·OH降解鄰苯二甲酸二乙酯[23]。

H2O2用于有機(jī)污染土壤修復(fù)時(shí)，H2O2的引入勢(shì)必對(duì)土壤基本性質(zhì)、微生物特征等產(chǎn)生影響，最終影響土壤的生態(tài)功能[24]。但目前關(guān)于這方面的研究較少，亟需系統(tǒng)評(píng)價(jià)H2O2對(duì)土壤生態(tài)功能等方面指標(biāo)如土壤有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和微生物的影響。為此，本文將系統(tǒng)研究H2O2、類芬頓體系如V2O3/H2O2和檸檬酸鐵/H2O2對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮及微生物等指標(biāo)的影響，以為評(píng)價(jià)基于H2O2化學(xué)氧化修復(fù)污染土壤的生態(tài)安全提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤為采自江蘇省張家港市的某滲育型水稻土，采集深度為0 ~ 20 cm，經(jīng)室內(nèi)自然風(fēng)干、研磨過10目篩備用。土壤中有機(jī)質(zhì)含量為37.2 g/kg，pH為6.4，釩基底值為84.4 mg/kg，電導(dǎo)率為307.85 μs/cm，陽(yáng)離子交換量為15.1 cmol/kg，F(xiàn)e2O3含量為8.23 g/kg，Al2O3含量為1.03 g/kg。

1.2 藥品與試劑

過氧化氫(H2O2)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%；三氧化二釩(V2O3，99%)，購(gòu)自Stream Chemicals, INC；氯化鉀、檸檬酸、七水合硫酸亞鐵、硫酸鈦為分析純，購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

稱量天平：Sartorius(BAS124S)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)：TG16-WS，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)：UV2700，日本島津；超純水儀：Ultrapure(type1)water，德國(guó)密理博；凍干機(jī)：ALPHA 1-2 LD plus，德國(guó)格馬；pH計(jì)：Thermo scientific，賽默飛世爾科技有限公司；恒溫震蕩箱：IS-RDV1，上海珂淮儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 不同處理H2O2投加試驗(yàn) H2O2的用量采用場(chǎng)地土壤修復(fù)的常用劑量200 mmol/L，通過分批投加的方式，投加4次，每次50.0 mmol/L，待上一批次H2O2消耗完畢后，繼續(xù)添加50 mmol/L。試驗(yàn)中液土比為2∶1(/)，設(shè)置3種處理方式：①單獨(dú)投加H2O2體系：稱取10 g土置于100 ml敞口三角瓶?jī)?nèi)，H2O2的投加濃度為50 mmol/L，分4次投加，每次投加0.2 ml 5.0 mol/L的H2O2母液，最終反應(yīng)體系為20 ml土壤懸液；②V2O3/ H2O2體系：稱取10 g土置于100 ml敞口三角瓶?jī)?nèi)，H2O2的投加方式和量同處理①，V2O3粉末投加量為0.001 g；③檸檬酸鐵/H2O2體系：稱取10 g土置于100 ml敞口三角瓶?jī)?nèi)，H2O2的投加方式和量同處理①，用檸檬酸和硫酸亞鐵按照1∶1(/)比例配制檸檬酸鐵溶液，再以檸檬酸鐵溶液與H2O2比例1∶100 (/)投加。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)置單獨(dú)10 g土 + 20 ml超純水的處理作為對(duì)照體系。

每個(gè)處理設(shè)置8組樣品，每組樣品3個(gè)平行，采用破壞性取樣方式，分別于反應(yīng)后1、3、5、7、10、14、21、28 d混勻后吸取5 ml上層液過0.45 μm水系針式濾器，將濾液保存于4℃冰箱備測(cè)。測(cè)定濾液中H2O2濃度和溶解性有機(jī)碳(DOC)含量，根據(jù)土壤中實(shí)際測(cè)得的H2O2濃度來確定添加H2O2的時(shí)間。當(dāng)H2O2完全分解，再繼續(xù)添加濃度為50 mmol/L的H2O2于剩余樣品中，以此類推。并將剩余的水土混合樣品分別全部轉(zhuǎn)移到50 ml康寧管后進(jìn)離心機(jī)(TG16-WS，上海)，以4 500 r/min速度離心10 min后倒掉上清液，置于–70℃冰箱冷凍后進(jìn)凍干機(jī)中冷凍干燥48 h后常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的提取 將經(jīng)過冷凍干燥處理的土壤樣品置于研缽中研磨過篩后，按照固液比1∶4(/)的比例，稱取2.0 g土置于15 ml康寧管，投加8 ml濃度為2 mol/L 的KCl溶液后置于條件為25℃、200 r/min的恒溫振蕩箱中提取1 h，再以4 500 r/min的速度離心8 min后，取5 ml上清液至離心管中待測(cè)。

1.4.3 土壤微生物的提取 本試驗(yàn)使用的是MP FastDNA提取試劑盒法來提取經(jīng)冷凍干燥處理后保存?zhèn)溆猛寥乐械腄NA。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：稱取已冷凍干燥過的0.5 g土壤到2.0 ml的裂解介質(zhì)管中，在FastPrep核酸提取儀中混勻；將裂解介質(zhì)管離心，提取上清液轉(zhuǎn)移到離心管中，在上清液中加入蛋白質(zhì)沉淀劑(PPS)試劑，手動(dòng)混勻；再次離心后，提取上清液轉(zhuǎn)移到離心管中，在上清液中加入結(jié)合基質(zhì)懸浮液；將離心管上下倒置2 min后靜置，使DNA附著于結(jié)合基質(zhì)懸浮液并等待二氧化硅基質(zhì)沉淀；棄上清液，重懸結(jié)合基質(zhì)中的剩余液體。將混合物轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)過濾器(置于接管中)中，多次離心，倒空接管中的液體；添加鹽/乙醇洗滌液(SEW-M)到旋轉(zhuǎn)過濾器混勻再次離心，倒空接管，重復(fù)操作一次；離心旋轉(zhuǎn)過濾器，清干剩余的SEW-M，移動(dòng)旋轉(zhuǎn)過濾器到干凈的離心管中，室溫風(fēng)干5 min；加入DNA洗脫液(DES)輕輕混勻后，放置在水浴鍋中水浴5 min后離心過濾；將提取好的DNA放置在冰上，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度和純度。針對(duì)DNA含量較低的或是雜質(zhì)較多的，采用PCR擴(kuò)增并經(jīng)過純化以后，再進(jìn)行高通量測(cè)序，PCR擴(kuò)增的條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，55℃變性50 s，72 ℃變性45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃結(jié)束。

1.4.4 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定 土壤懸液DOC測(cè)定：將過0.45 μm濾器的濾液經(jīng)過不同稀釋倍數(shù)稀釋定容至20 ml，使用Jena Muiti 3100總有機(jī)碳/總氮分析儀測(cè)定。

土壤有機(jī)質(zhì)測(cè)定：將經(jīng)過冷凍干燥處理的土壤樣品稱取5.0 g置于研缽中，研磨過篩后取3.0 g用塑封袋分裝每一個(gè)土壤樣品，使用電位滴定儀測(cè)定。

土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮測(cè)定：根據(jù)土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮提取方法提取出的5 ml上清液樣品，使用流動(dòng)分析儀Skalar(4)和流動(dòng)分析儀Skalar(2)進(jìn)行測(cè)定。

1.4.5 H2O2濃度測(cè)定 H2O2濃度用硫酸鈦顯色后用紫外可見分光光度計(jì)(島津UV2700，日本)測(cè)定[25]，并根據(jù)文獻(xiàn)和試驗(yàn)需要，優(yōu)化了試驗(yàn)條件和相關(guān)參數(shù)：首先配制0.4 mol/L的硫酸溶液，然后稱取一定質(zhì)量的硫酸鈦(Ti2(SO4)3)溶于0.4 mol/L H2SO4溶液中，配成硫酸鈦濃度為75 mmol/L的顯色反應(yīng)液。再投加一定體積的反應(yīng)濾液至顯色體系中，顯色體系為10 ml，顯色5 min，使用紫外分光光度計(jì)在410 nm條件下比色測(cè)定。

1.4.6 土壤微生物測(cè)序 經(jīng)擴(kuò)增和純化后的土壤微生物樣品，采用Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

文中數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析分別使用Origin 8.5和SPSS19.0軟件，土壤微生物數(shù)據(jù)采集用Mothur軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同處理H2O2濃度變化

已有的研究表明，逐步投加較低濃度的H2O2到土壤中對(duì)土著菌的影響較小，可以進(jìn)一步提升微生物降解土壤污染物的能力。因而本試驗(yàn)參考選取了逐步投加H2O2的方式。不同處理H2O2分解動(dòng)力學(xué)結(jié)果如圖1所示，可見，單獨(dú)投加H2O2和V2O3/H2O2兩個(gè)處理下，H2O2緩慢逐漸分解，到反應(yīng)5 d時(shí)基本分解完全；此時(shí)繼續(xù)投加H2O2，反應(yīng)7 d時(shí)H2O2濃度變化不明顯，而反應(yīng)至10 d時(shí)H2O2已經(jīng)被分解完全；繼續(xù)第3次投加H2O2，反應(yīng)至14 d時(shí)H2O2被分解完全后；接著第4次投加H2O2，反應(yīng)21 d時(shí)H2O2被分解完全。而檸檬酸鐵/H2O2體系中，H2O2從一開始投加后，3 d內(nèi)被迅速分解，在后續(xù)的投加過程中均未檢測(cè)到H2O2的殘留，這主要是由于檸檬酸鐵催化分解H2O2的活性較高，H2O2一經(jīng)加入立刻被分解。

H2O2進(jìn)入土壤后很快被分解，主要原因有兩個(gè)方面：①土壤組分消耗H2O2，土壤中有機(jī)質(zhì)含量較高，H2O2投入以后，土壤有機(jī)質(zhì)的氧化會(huì)迅速地消耗H2O2，同時(shí)土壤中鐵錳等礦物也會(huì)催化分解H2O2產(chǎn)生羥基；②催化劑如檸檬酸鐵、V2O3等也能快速地催化分解H2O2。以上結(jié)果表明，在實(shí)際利用H2O2修復(fù)有機(jī)污染土壤時(shí)，土壤組分也會(huì)消耗H2O2從而影響氧化劑的利用和修復(fù)效率。

(圖中1st、2nd、3rd、4st分別表示H2O2第一、二、三、四次投加)

2.2 不同處理土壤DOC濃度變化

土壤有機(jī)質(zhì)含量不僅是土壤肥力的重要指標(biāo)，也是評(píng)價(jià)有機(jī)污染物生物有效性的重要因子，因?yàn)橛袡C(jī)污染物大多以有機(jī)質(zhì)結(jié)合態(tài)的形式存在。通常在單獨(dú)H2O2/土壤體系中，H2O2也能被快速分解，說明有機(jī)質(zhì)能夠消耗H2O2，因此對(duì)反應(yīng)過程中的土壤有機(jī)質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)十分必要。圖2顯示，在逐步芬頓氧化以后，添加了H2O2的3個(gè)處理樣品懸液DOC含量是空白對(duì)照的10倍左右。單獨(dú)H2O2處理和V2O3/H2O2處理變化趨勢(shì)基本一致，反應(yīng)5 d時(shí)DOC含量達(dá)到最大，隨后迅速下降，反應(yīng)7 d時(shí)達(dá)到1 100 mg/L，但相比于對(duì)照，DOC含量仍然很高，且在10 d時(shí)出現(xiàn)緩慢回升的現(xiàn)象，原因可能是10 d時(shí)H2O2被土壤中的有機(jī)質(zhì)或V2O3消耗完全，固定在土壤中的有機(jī)碳溶解到水中；反應(yīng)14、21、28 d時(shí)DOC含量繼續(xù)下降，并在反應(yīng)28 d時(shí)達(dá)到基本穩(wěn)定的狀態(tài)，主要原因是隨著H2O2的持續(xù)加入，溶解態(tài)的有機(jī)碳被進(jìn)一步礦化成二氧化碳，從而導(dǎo)致DOC含量的下降。但檸檬酸鐵/H2O2處理在反應(yīng)的前7 d內(nèi)DOC含量遠(yuǎn)低于其他H2O2處理，最大值僅為2 000 mg/L，隨著反應(yīng)的進(jìn)行DOC含量逐漸降低，7 d后基本穩(wěn)定在600 mg/L，這主要是因?yàn)闄幟仕徼F與H2O2反應(yīng)活性較高，競(jìng)爭(zhēng)性抑制了土壤有機(jī)質(zhì)與H2O2或羥基的反應(yīng)，從而降低了土壤中有機(jī)碳的釋放速度，導(dǎo)致水溶液中DOC含量較為穩(wěn)定。而對(duì)照中DOC含量始終很低，表明添加H2O2會(huì)對(duì)土壤中固定的有機(jī)碳產(chǎn)生影響。

圖2 不同處理DOC含量隨時(shí)間的變化

2.3 不同處理土壤有機(jī)質(zhì)含量變化

以上結(jié)果表明，土壤有機(jī)質(zhì)在添加H2O2后會(huì)隨之分解。圖3顯示了不同處理有機(jī)質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化，可見，單獨(dú)投加H2O2和V2O3/H2O2處理隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，有機(jī)質(zhì)含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，反應(yīng)前5 d下降趨勢(shì)不明顯，但至7 d時(shí)有機(jī)質(zhì)含量從37.2 g/kg 迅速下降到了22.3 g/kg，這是因?yàn)殡S著H2O2在土壤中投加量的增加，對(duì)土壤中有機(jī)碳的消耗也增多，因此測(cè)得的有機(jī)質(zhì)含量下降較多；而檸檬酸鐵/H2O2處理在反應(yīng)的前5 d相比其他兩個(gè)處理，有機(jī)質(zhì)含量為其一半，這主要原因是檸檬酸鐵與H2O2反應(yīng)活性較高，在一開始就將土壤中固定的有機(jī)碳激活釋放出來，而至7 d時(shí)已基本保持穩(wěn)定，這也表明反應(yīng)7 d后3個(gè)處理土壤內(nèi)部易分解的有機(jī)碳已全部釋放。而通過對(duì)照有機(jī)質(zhì)含量數(shù)據(jù)可看出，土壤中原始有機(jī)質(zhì)含量大約為37 g/kg，投加H2O2處理均降低了有機(jī)質(zhì)的含量。眾所周知，有機(jī)質(zhì)具有很多優(yōu)點(diǎn)，它能夠提高土壤溫度、增強(qiáng)保水保肥性和緩沖性，同時(shí)為植物提供大量的有效養(yǎng)分，還可與進(jìn)入土壤中的化學(xué)農(nóng)藥結(jié)合，降低或延緩重金屬的污染，對(duì)農(nóng)藥等有機(jī)污染物具有固定作用，有利于全球碳平衡[2]。但H2O2的加入，會(huì)降低有機(jī)質(zhì)的含量，從而阻礙土壤微生物和動(dòng)物的活性。因此，在修復(fù)土壤的同時(shí)，還要種植綠肥、秸稈還田，促進(jìn)土壤中有機(jī)質(zhì)含量的提高，以降低H2O2投入土壤后造成的影響。

2.4 不同處理土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量

氮是作物生長(zhǎng)需求量和增產(chǎn)貢獻(xiàn)最大的營(yíng)養(yǎng)元素，土壤中的氮素大多以有機(jī)結(jié)合形態(tài)而存在，無(wú)機(jī)形態(tài)的氮一般只占全氮的1% ~ 5%。作物可直接吸收利用的礦質(zhì)態(tài)氮主要是銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO– 3-N)。北方土壤以硝態(tài)氮為主，南方水田以銨態(tài)氮為主。硝態(tài)氮促進(jìn)植物吸收陽(yáng)離子，有利于有機(jī)陰離子合成；而銨態(tài)氮?jiǎng)t促進(jìn)吸收陰離子，消耗有機(jī)酸。一般而言，同時(shí)施用銨態(tài)氮和硝態(tài)氮肥能提高作物的長(zhǎng)勢(shì)和產(chǎn)量。本試驗(yàn)測(cè)得的不同處理土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮結(jié)果如圖4所示，可見，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，投加H2O2的3個(gè)處理土壤銨態(tài)氮含量具有明顯上升的趨勢(shì)，尤其是單獨(dú)投加H2O2處理，土壤中銨態(tài)氮的含量在反應(yīng)1 d時(shí)就顯著高于其他處理；而對(duì)照中銨態(tài)氮的含量很低，且變化趨勢(shì)不明顯。這說明添加H2O2能夠有效增加土壤中銨態(tài)氮的含量；對(duì)于硝態(tài)氮，無(wú)論是投加H2O2處理還是對(duì)照，土壤硝態(tài)氮含量均在反應(yīng)5 d時(shí)達(dá)到最大值6 mg/L，且變化趨勢(shì)一致。造成銨態(tài)氮上升和硝態(tài)氮變化不明顯的原因可能是H2O2的添加影響了氮轉(zhuǎn)化的微生物活性，深層次的原因有待進(jìn)一步闡明。

圖3 不同處理土壤有機(jī)質(zhì)含量隨時(shí)間的變化

圖4 不同處理下土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量的變化

2.5 不同處理土壤微生物的高通量測(cè)序

本研究利用高通量測(cè)序方法，使用mothur軟件經(jīng)前期預(yù)處理共獲得1 006 090條細(xì)菌序列，各樣品中所得序列數(shù)在12 293 ~ 30 021條，進(jìn)一步處理前，對(duì)每個(gè)樣品中序列數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使得每個(gè)樣品的最終序列數(shù)統(tǒng)一為12 000條。經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)菌分屬于22個(gè)門，其中主要門類包括Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Verrucomicrobia(疣微菌門)(圖5)。反應(yīng)28 d時(shí)數(shù)據(jù)顯示，H2O2處理明顯減少了微生物的多樣性，原因可能是H2O2殺死了土壤中部分微生物。

從圖5中還可以看出，單獨(dú)投加H2O2處理與檸檬酸鐵/H2O2處理在不同時(shí)間的物種豐度上沒有明顯差異，均以厚壁菌門為主。厚壁菌門是原核生物界中一類細(xì)胞壁厚度為10 ~ 50 nm的細(xì)菌高級(jí)分類單元，包括一大類細(xì)菌，多數(shù)為革蘭氏陽(yáng)性。很多厚壁菌可以產(chǎn)生芽孢，它可以抵抗脫水和極端環(huán)境。在不同時(shí)間點(diǎn)的樣品中厚壁菌門的相對(duì)豐度均在98% 以上，另外還有一小部分的變形菌門占比1% 左右，土壤群落物種結(jié)構(gòu)較為單一。V2O3/H2O2處理也是以厚壁菌門為主，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，厚壁菌門的相對(duì)豐度從87.67% 上升到了91.1%，但是相對(duì)于前兩個(gè)處理，該處理?xiàng)l件下微生物的豐度較高，變形菌門的相對(duì)豐度均在8% 以上。對(duì)照處理在反應(yīng)1 d時(shí)的微生物豐度相比于其他處理較大，但各菌門所占比例遠(yuǎn)不及厚壁菌門，而28 d時(shí)微生物的豐度顯著提高，且各菌門所占比例也大幅度提升，其中擬桿菌門占比從0.12% 提高到6.96%、變形菌門從4.94% 提高到42.32%。因此，在土壤中添加H2O2會(huì)降低微生物的多樣性。

2.6 不同處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異性

運(yùn)用SPSS軟件采用Tukey test方法對(duì)每一個(gè)細(xì)菌門下各處理間的差異性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)投加H2O2處理與檸檬酸鐵/H2O2處理的厚壁菌門同V2O3/ H2O2處理和對(duì)照具有顯著性差異。

(圖例中“Others”代表相對(duì)豐度<0.2%的門)

在門的分類水平上，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)如圖6所示，可見，H2O2處理土壤與原土壤中微生物群落較為類似；對(duì)照土壤則隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)生了很大變化；投加H2O2的3個(gè)處理和對(duì)照反應(yīng)樣品的群落結(jié)構(gòu)具有較高的相似度，且檸檬酸鐵/H2O2處理各反應(yīng)時(shí)間樣品之間的相似度更高。

圖6 在門的分類水平上的群落結(jié)構(gòu)分布圖

在屬的分類水平上，總共有363個(gè)被檢出，結(jié)果如下圖7示?？傮w而言，群落結(jié)構(gòu)變化PCoA圖和cluster聚類分析表明，H2O2處理與對(duì)照的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬的分類水平上表現(xiàn)出明顯不同。3種H2O2處理具有較高的相似度，尤其是單獨(dú)H2O2處理和檸檬酸鐵/H2O2處理的相似度極高。

圖7 在屬的分類水平上的群落結(jié)構(gòu)分布圖

表1數(shù)據(jù)顯示，因H2O2處理而發(fā)生改變的細(xì)菌屬有以下兩種情況：①因H2O2處理而豐度有明顯增加的屬主要有厚壁菌門中的芽孢桿菌屬()、乳球菌屬()、大洋芽孢桿菌()、土芽孢桿菌屬()、鏈球菌屬()等，變形菌門中的假單胞桿菌屬()，在V2O3/H2O2處理中的不動(dòng)桿菌屬()；②因H2O2處理而豐度有所減少的屬主要有厚壁菌門中梭狀芽孢桿菌()、變形菌門中的鞘氨醇單胞菌屬()以及未分類的一些菌屬等。綜上結(jié)果可以看出，F(xiàn)enton試劑對(duì)土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生了很大的影響。通過對(duì)比試驗(yàn)中3個(gè)不同處理發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)投加H2O2處理和檸檬酸鐵/H2O2處理微生物的豐度較低，而V2O3/H2O2處理對(duì)土壤微生物的影響相對(duì)較小?？傮w而言，在門的分類水平上，3個(gè)H2O2處理微生物群落結(jié)構(gòu)與處理前的土壤微生物群落較為類似。反映群落結(jié)構(gòu)變化的PCoA圖和cluster聚類分析顯示3個(gè)H2O2處理與對(duì)照的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬的分類水平上明顯不同，但3個(gè)H2O2處理之間具有較高的相似度，尤其是單獨(dú)H2O2處理和檸檬酸鐵/H2O2處理。

表1 H2O2處理細(xì)菌豐度增加和降低的菌屬

續(xù)表1

注：表中數(shù)字為豐度(%)。

3 結(jié)論

投加Fenton試劑進(jìn)入土壤后， H2O2在土壤中會(huì)快速分解，使土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著下降，土壤銨態(tài)氮含量顯著升高，但土壤硝態(tài)氮含量變化不明顯。另外，F(xiàn)enton試劑也會(huì)對(duì)土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生很大影響。通過對(duì)比試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)投加H2O2和檸檬酸鐵/H2O2處理微生物的豐度較低，而V2O3/H2O2處理對(duì)土壤微生物的影響相對(duì)較小。在門的分類水平上，3個(gè)H2O2處理對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響較小，但對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬的分類水平上影響較大。以上研究為H2O2和芬頓試劑修復(fù)場(chǎng)地土壤的生態(tài)安全評(píng)價(jià)提供了數(shù)據(jù)支撐。

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Effect of Hydrogen Peroxide and Fenton-like Reagent on Soil Carban, Nitrogen and Microorganism

ZHOU Yang1,2, DENG Yamei2,3, ZHU Fengxiao2, ZHAO Guangchao1*, FANG Guodong2*, WANG Rongfu3,4, ZHOU Dongmei2

(1 College of Environmental Science and Engineering, Anhui Normal University, Wuhu,Anhui 241002; 2 Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008; 3 School of Resources and Environment, Anhui Agricultural University, Hefei, Anhui 230036; 4 School of International Tourism, Anhui International Studies University, Hefei 231201, China)

Hydrogen peroxide-based Fenton or Fenton-like reactions have been used extensively for the remediation of organic pollutants in the contaminated sites. However, the effects of H2O2or Fenton reactions on soil properties and microbial communities are not fully understood. In this study, the effects of H2O2and different Fenton reagents including H2O2, H2O2/V2O3and H2O2/citrate chelated ferric on soil properties and microbial communities were studied. The results showed that H2O2was decomposed quickly in soil accompanied with obvious degradation of soil organic matter (SOM), dramatic increase of soil ammonium nitrogen, and slight change of soil nitrate nitrogen. High-throughput sequencing was used to analyze microbial multi-samples and biome structure in soil, and it was found that H2O2and Fenton reagents significantly reduced soil microbial diversity.

H2O2; Fenton-like; Soil properties; Soil microbial diversity; Community structure

X53

A

10.13758/j.cnki.tr.2020.05.014

周洋, 鄧亞梅, 朱鳳曉, 等. 過氧化氫及類芬頓試劑對(duì)土壤碳、氮和微生物的影響. 土壤, 2020, 52(5): 969–977.

江蘇省杰出青年基金項(xiàng)目(BK20170050)和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題(2017YFA0207001)資助。

周洋(1993—)，男，江蘇南京人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橛袡C(jī)污染土壤修復(fù)。E-mail: zhouyangsms@163.com