PI3K信號通路在慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道及系統性炎癥中的作用

陳忠仁 歐宗興 王蕾 沈彬 梁海梅 楊緒莉 黃實仁

(中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院呼吸與危重癥醫學科，海南 海口 570208)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣流受限持續存在為主要臨床特征、異常的氣道炎癥為主要病理特征的慢性氣道炎癥性疾病。COPD特征之一就是系統性炎癥〔1〕。 隨著研究的深入，研究者不僅發現COPD患者在急性期存在系統性炎癥，在穩定期系統性炎癥也持續的存在〔2，3〕。但COPD的氣道炎癥是如何啟動，通過何種途徑引起血液中細胞因子級聯瀑布反應而損害肺外器官引起并發癥，目前尚無定論。本研究通過制備COPD大鼠模型，探討磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號通路在COPD大鼠氣道炎癥及系統性炎癥中的作用。

1 材料與方法

1.1.1動物 健康清潔級 wistar 大鼠 36只，體重 220～250 g，由斯萊克提供。

1.1.2主要試劑 內毒素(Sigma)；LY294002(MCE)；轉錄試劑盒、預混液( TAKARA公司)；白細胞介素(IL)-18酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(南京建成)、IL-1β ELISA 試劑盒(南京建成)；紅梅牌香煙(紅塔集團)。

1.1.3主要儀器與設備 酶標儀(MK3)THERMO；熒光定量PCR儀(LightCycler?96)羅氏；正置顯微鏡(BK-FL2)重慶奧特光學儀器有限公司；煙熏染毒箱(自制)。

1.2動物模型的制備及分組 采用隨機數字表法將 36 只 1 月齡健康清潔級Wistar 大鼠隨機平均分為COPD組、干預組、空白組。COPD組和干預組依據宋一平〔4〕的方法造模。方法如下：第1天和第14天經氣管滴入2 000 μl(質量濃度為 1 μg/μl)內毒素后2～30 d(第14天除外)，將大鼠放入5%香煙煙霧中熏0.5 h/d。干預組在每次煙熏前1 h，均予腹腔注射LY294002，劑量為1.5 mg/kg〔LY294002溶于二甲基亞砜(DMSO)，0.9%氯化鈉注射液稀釋至50 μl〕。而COPD 組和空白組在煙熏前腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3ELISA檢測 采用雙抗體兩步夾心 ELISA 檢測 IL-18、IL-1β 的水平，按試劑盒說明書操作，最后通過酶標儀和計算機得出細胞因子濃度 。

1.4Real-time PCR檢測氣道平滑肌細胞PI3K mRNA及血淋巴細胞NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白(NLRP)3 mRNA 取大鼠肺組織和血中淋巴細胞，加入 TRIzol 提取總RNA，逆轉錄合成 cDNA。將獲得的 cDNA 按PCR試劑盒說明書方法擴增目的基因。引物β-actin正義鏈GGAGAAGATTTGGCACCACAC，β-actin反義鏈ACACAGCCTGGATGGCTACG，片段長度173 bp。PI3K正義鏈CTGGAATGTGTGGCTGGAGT，PI3K反義鏈AGGAGGAGCGGTGGTCTAT，片段長度198 bp。NLRP3正義鏈AGCTCCTCTGTGAGGGACTT，NLRP3反義鏈GAGCGTCACCACACACAGAT，片段長度179 bp。反應條件：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s共40～45個循環。計算Ct值，應用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.5氣道平滑肌細胞分離培養及鑒定 每組大鼠最后一次激發24 h內, 綁好大鼠，取肺放入燒杯，清洗肺部，用鑷子將肺的內外膜除去，只剩下平滑肌。用眼科剪將肺部剪成 1～2 mm的小碎塊。將碎塊移入配好的消化液(含 1 mg/mlⅠ型膠原酶、1 mg/ml木瓜蛋白酶、10 mg/ml牛血清白蛋白的平衡鹽溶液)中，放入培養箱中，消化15 min。取出，加入無血清的細胞培養液，約10 ml，移入離心管中。980 r/min，離心10 min。倒掉上清，加入約1 ml含20%胎牛血清的細胞培養液。將碎塊用滴管加入25 ml的培養瓶里,置于37℃ 5% CO2培養箱中培養,每2～3 d換一次液,7 d左右細胞融合 80%后傳代培養,實驗用2～5代細胞。培養細胞通過形態學觀察并經α-actin免疫熒光染色鑒定。

1.6蘇木素-伊紅染色顯微鏡下觀察肺組織病理 制大鼠肺組織石蠟切片，后予二甲苯脫蠟，續用酒精水化，后1%伊紅酒精染色，接著酒精梯度脫水，用二甲苯透明，最后封片，在顯微鏡下觀察肺組織病理。

1.7統計學處理 使用GraphPad Prism6.0 和SPSS22.0 統計軟件進行單因素方差分析、Pearson分析法。

2 結 果

2.13 組基本情況比較 空白組進食飲水正常，精神活躍，呼吸平順，毛發潔白光澤，活動靈敏，反應迅速；而另外兩組在造模過程中逐漸出現營養差，呼吸急促，反應遲鈍，進食減少，皮毛枯槁發黃。

2.2氣道平滑肌細胞(ASMCs)鑒定及肺組織病理 在顯微鏡下ASMCs有長突起，表現梭形，為典型“峰-谷狀”生長；α-actin免疫熒光染色后為細胞質為棕黃色，呈陽性反應，鑒定培養的細胞為平滑肌細胞。光鏡下可見COPD組支氣管上皮增生增厚，管腔內大量炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 ASMCs鑒定及肺組織病理

2.33組PI3K、NLRP3 mRNA及細胞因子水平分析 與空白組比較，COPD組IL-18、IL-1β及NLRP3、PI3K mRNA顯著升高(P<0.05)；與COPD組比較，干預組以上指標均顯著降低(P<0.05)。肺泡灌洗液中IL-18、IL-1β水平顯著低于血清(P<0.05)。見表1。

表1 3組細胞因子及NLRP3、PI3K mRNA的表達

2.43組PI3K mRNA水平與細胞因子之間相關性分析 PI3K mRNA水平與血清IL-18(r=0.805)、 IL-1β(r=0.757)水平呈顯著正相關(P<0.05)。

3 討 論

COPD最可能的機制就是氣道炎癥的外溢機制〔5〕。近來，隨著人們對炎性小體認識的加深，它在COPD中發生、發展的作用逐漸被人認識到。炎癥小體是一種多蛋白復合物，分布于細胞質中，可以被多種病原相關分子模式(PAMP)和危險相關分子模式(DAMP)激活〔6〕。COPD患者中的病原體相關分子及氧化應激分子可以激活炎性小體，而激活的炎性小體可招募并激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水平解酶(caspase)-1，剪切IL-1和IL-18前體，產生相應的成熟細胞因子發揮生物學作用〔7〕。

PI3K屬于脂質激酶的家族，可使肌醇環第3位羧基磷酸化為磷脂酰肌醇激酶，具有蛋白激酶和類脂激酶雙重活性。PI3K是caspase-1激活的最為公認的上游機制〔8，9〕。有研究指出，可通過抑制PI3K磷酸化來減少NLRP3表達。

研究發現，NLRP3炎癥小體及細胞因子IL-18和IL-1β參與了COPD的發病〔10〕。IL-1β是由單核巨噬細胞分泌的細胞因子，可發揮炎癥反應、免疫應答的生物學作用。有研究發現，IL-1β能夠增加肺部多種細胞因子和細胞間黏附分子(ICAM)-1、血管細胞黏附分子(VCAM)-1、E-選擇素的水平，致使嗜酸粒細胞和中性粒細胞發生炎癥募集并浸潤到支氣管黏膜〔11〕。IL-18主要由巨噬細胞產生，在促進炎癥發生及對外來致病源免疫中起著重要的作用。陳慶蕓等〔12〕研究發現，IL-18可能跟COPD的氣道炎癥、系統炎癥和營養狀態的變化相關。

本研究表明LY294002能有效抑制PI3K的活性。通過制造COPD模型刺激了PI3K信號通路后，其下游的細胞因子如IL-1β、IL-18也得到激活、成熟、發揮生物作用，參與了肺組織的慢性炎癥過程。干預組的PI3K表達雖得到抑制，但肺泡灌洗液的細胞因子表達仍顯著高于空白組，說明細胞因子活化后，有自身的正反饋機制，不完全被上游信號抑制，這也可以解釋為何COPD穩定期患者氣道炎癥仍持續存在〔13，14〕。

本研究結果表明NLRP3 mRNA在各組大鼠的表達與PI3K一致，提示NLRP3作為PI3K的下游信號因子，抑制PI3K的表達可有效抑制NLRP3的活化這與Qiao等〔15〕的研究相符合。與大多數的研究所指出的一樣〔16〕，NLRP3炎性小體的活化可以使無活性的細胞因子前體產生為有生物學作用的細胞因子，在全身系統中持續產生炎癥作用。

研究表明 COPD 的炎癥反應不僅僅局限于肺部，而且存在全身的系統性炎癥。COPD 穩定期患者同樣存在著系統性炎癥，只是細胞因子的濃度較急性加重期低。因此系統性炎癥是 COPD 的主要特征之一〔1〕，這也是 COPD 呈進行性發展及存在并發癥的原因之一。 本研究發現，COPD作為一個以慢性氣道炎癥為特征的呼吸系統疾病，其血清的細胞因子表達，在3組大鼠中均高于肺泡灌洗液，提示氣道細胞因子外溢后，可能激活NLRP3及血清的細胞因子，產生級聯放大效應，誘發和維持肺外炎癥。本研究結果表明PI3K信號通路的激活，不僅可以活化肺部的炎癥，肺外炎癥一樣有促進作用；PI3K信號通路對肺外細胞因子的激活，使其發揮生物學作用，也可能是系統性炎癥產生及持續存在的原因。

綜上所述，抑制PI3K的表達，可以有效減少NLPR3、IL-1β、IL-18的活化，減輕COPD氣道炎癥及肺外炎癥，為防治COPD及并發癥提供新思路及新的治療位點。