高分子鍵合血管阻斷劑與BLZ945納米藥物協同治療腫瘤

王 月， 沈 娜， 衛 琦， 湯朝暉

（1. 中國科學院長春應用化學研究所，長春 130022；2. 中國科學院大學，北京 100049）

血管阻斷劑（VDAs）在癌癥治療中的巨大潛力引起了越來越多的關注[1-4]。康普瑞汀磷酸二鈉（CA4P）是一種具有代表性的小分子血管阻斷劑前藥，曾進行臨床III期試驗，其可以選擇性地靶向已建立的腫瘤脈管系統，導致腫瘤內部缺乏氧氣和營養的供給，從而引發大面積腫瘤壞死[5-8]。聚（L-谷氨酸）接枝聚乙二醇單甲醚/康普瑞汀A4（C-NPs）是一種血管阻斷劑納米前藥，它將CA4P的活性成分康普瑞汀A4（CA4）鍵合到載體上，借助納米粒子的瘤內低滲透性，使CA4主要分布在血管周圍，較CA4P具有增強的腫瘤血管靶向性；又由于CA4的作用靶點是血管內皮細胞，C-NPs的療效顯著優于CA4P[9-11]。C-NPs具有顯著的抗腫瘤療效和應用前景，然而報道表明其可導致腫瘤M2型腫瘤相關巨噬細胞（M2-TAMs）浸潤[12]。M2-TAMs與不良預后相關，在腫瘤血管生成、發展、轉移、免疫抑制和治療耐藥性中起著至關重要的作用[13,14]。M2-TAMs的增多，導致C-NPs治療后腫瘤復發，限制了其應用。因此，調控M2-TAMs介導的腫瘤免疫抑制微環境，有助于提升C-NPs的抗腫瘤療效。

BLZ945是一種高度選擇性的集落刺激因子-1受體（CSF-1R）抑制劑，其通過阻斷腫瘤細胞分泌的集落刺激因子-1（CSF-1）與CSF-1R的結合來降低M2-TAMs的比例[15,16]。Pyonteck等[17]報道通過BLZ945抑制CSF-1/CSF-1R信號通路能夠大幅度降低M2-TAMs的數量，并促進腫瘤浸潤CD8+T細胞，共同抑制腫瘤生長。因此，BLZ945有望調控腫瘤免疫微環境，增強C-NPs抗腫瘤療效。然而，CSF-1R在腫瘤微環境中廣泛表達，不僅在M2-TAMs上表達，在單核吞噬系統中大多數細胞上也高表達，使得BLZ945這種小分子CSF-1R抑制劑容易脫靶[18]，甚至誘發肝臟毒性[19]。又鑒于M2-TAMs更傾向于富集在腫瘤血管周圍區域[20]，將BLZ945納米化，有望提高BLZ945的腫瘤靶向能力，減小副作用，增強抗腫瘤療效。

本文首先驗證了BLZ945能夠誘導M2-TAMs凋亡，并可與C-NPs協同抑制腫瘤生長。隨后設計并制備了高分子鍵合血管阻斷劑與BLZ945納米藥物（聚（L-谷氨酸）接枝聚乙二醇單甲醚/康普瑞汀A4/BLZ945，簡稱CB-NPs），其同樣能夠在腫瘤血管周圍富集，釋放小分子CA4破壞腫瘤血管，使腫瘤發生大面積缺血性壞死；同時，在腫瘤血管周圍釋放BLZ945，誘導由CA4導致浸潤增多的M2-TAMs的凋亡，降低腫瘤內M2-TAMs數量，逆轉免疫抑制微環境，進而協同治療腫瘤。因此，CB-NPs納米藥物在提高BLZ945的腫瘤靶向能力的同時，增強了其協同抗腫瘤能力，為血管阻斷劑的聯合抗腫瘤治療提供了理論基礎。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

通過文獻[21]的方法制備聚（L-谷氨酸）接枝聚乙二醇單甲醚；CA4：化學純，杭州瑞樹生化有限公司；BLZ945：實驗純，上海筆昔化工有限公司；4-二甲基氨基吡啶（DMAP）：化學純，中國阿拉丁試劑有限公司；2,4,6-三氯苯甲酰氯：實驗純，天津市希恩思生化科技有限公司；N,N′-二異丙基碳二亞胺（DIC）：化學純，北京伊諾凱科技有限公司。

細胞培養基、培養試劑購自BI和Gibco公司；重組小鼠白細胞介素4（IL-4）購自PeproTech（美國）生物科技有限公司；凋亡試劑盒購自大連美侖生物技術有限公司；FITC標記的抗小鼠CD206和PerCP/Cy5.5標記的抗小鼠F4/80抗體購自美國BD公司；雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 C-NPs的制備

C-NPs的合成路線如圖1所示。首先，通過聚谷氨酸（PLG）和聚乙二醇單甲醚（mPEG5k-OH）的Steglich酯化反應制備 PLG-g-mPEG。具體方法為：將 PLG（0.413 g，0.02 mmol）和 mPEG5k-OH（1.239 g，0.248 mmol）溶解在 25 mL 二甲基甲酰胺（DMF）中，然后將 DIC（93.67 mg，0.74 mmol）和 DMAP（10 mg，0.82 mmol）加入到反應體系中。上述混合物在25 ℃下反應72 h后，將溶液用過量的冰乙醚沉降，并用乙醚洗滌2次。最后，將沉降物用蒸餾水透析（透析膜的截留分子量MCWO = 3 500）3 d，冷凍干燥后獲得PLG-g-mPEG。通過酯化反應將CA4鍵合到PLG-g-mPEG上。具體實驗方法為：將PLG-g-mPEG（900 mg）溶解于30.0 mL無水DMF中，然后將 2,4,6-三氯苯甲酰氯（330 mg，1.35 mmol）和三乙胺（TEA）（140 mg，1.39 mmol）加入其中溶解，攪拌20 min 后，將溶解于 10 mL 無水 DMF 的 CA4（215 mg，0.68 mmol）和 DMAP（100 mg，0.82 mmol）加入其中，在60 ℃下反應4 h。反應混合物用過量的冰無水乙醚沉降，將沉降物重新溶解在DMF中，并用蒸餾水透析48 h，凍干后獲得最終產物C-NPs。

圖1 C-NPs的合成路線Fig. 1 Synthetic routes of C-NPs

1.3 CB-NPs的制備

CB-NPs的合成路線如圖2所示。通過酯化反應將CA4和BLZ945共同鍵合到PLG-g-mPEG上。具體方法為：將 PLG-g-mPEG（500 mg）溶于 15 mL無水 DMF中，再依次加入 2,4,6-三氯苯甲酰氯（213 mg,0.87 mmol）和三乙胺（83 mg, 0.83 mmol），反應 20 min 后將溶于 10 mL 無水 DMF 中的 CA4（80 mg, 0.25 mmol）、BLZ945（75 mg, 0.19 mmol）和 DMAP（64 mg, 0.53 mmol）加入到上述反應體系中，在 60 ℃ 條件下反應 4 h。反應結束后用過量無水乙醚對反應混合物進行沉降。沉降產物在DMF中復溶，用蒸餾水透析（MWCO = 3 500）72 h，冷凍干燥后得到最終產物CB-NPs。

1.4 CA4和BLZ945載藥量測試

首先用0.1 mol/L NaOH溶液將CB-NPs完全水解，然后用1.4 mol/L H3PO4溶液進行中和，利用高效液相色譜測定其中CA4和BLZ945的質量分數（載藥量）。

1.5 細胞培養

小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7）用胎牛血清體積分數為10%的1640培養基進行培養；小鼠結腸癌細胞（C26）用含有10%（體積分數）胎牛血清、50 U/mL青霉素和50 U/mL鏈霉素的高糖DMEM培養基進行培養；所有細胞放置于含5%（體積分數）二氧化碳和95%（體積分數）空氣（其中 O2的體積分數約20%）的37 ℃無菌培養箱中培養。

圖2 CB-NPs的合成路線Fig. 2 Synthetic routes of CB-NPs

1.6 細胞凋亡分析

利用凋亡試劑盒檢測BLZ945對RAW264.7細胞的毒性。將RAW264.7細胞置于6孔板中（每孔1×105個細胞），使其達到50%的細胞融合度。然后將培養基換成無血清1640培養基并用100 ng/mL重組小鼠IL-4刺激細胞24 h，當融合度達到80%時將細胞分為兩組：一組作為對照組正常培養；另一組加入67 nmol/L的BLZ945孵育12 h，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌收集細胞。根據細胞凋亡檢測試劑盒的說明，用Annexin VFITC和Propidium iodide（PI）進行細胞染色，室溫避光孵育15 min，利用流式細胞儀進行染色分析，使用FlowJo軟件進行數據分析。

1.7 流式細胞分析

將原始RAW264.7細胞接種于6孔板中，每孔1×105個細胞，使其達到50%的細胞融合度。然后將培養基換成無血清1 640培養基并用100 ng/mL重組小鼠IL-4刺激細胞24 h。IL-4刺激后，加入含有BLZ945（67 nmol/L）的1 640培養基孵育12 h。藥物作用結束后收集細胞，分別用CD206和F4/80抗體對細胞進行染色，利用流式細胞儀進行染色分析，使用FlowJo軟件進行結果分析。

1.8 體內抑瘤評價

C-NPs與小分子BLZ945聯用增強C-NPs的抗腫瘤療效驗證：將2.0×106個C26細胞接種在雌性BALB/c小鼠（體重約18 g，6～8周齡）右下腹部，構建小鼠結腸癌腫瘤模型。當腫瘤生長至約220 mm3時，將小鼠隨機分為 4組：⑴ PBS；⑵ C-NPs（30 mg/kg的 CA4用量）；⑶ C-NPs（30 mg/kg的 CA4用量+ BLZ945（5 mg/kg腹腔注射））；⑷ C-NPs（30 mg/kg的 CA4用量+BLZ945（5 mg/kg瘤內注射））。每組 5 只 BALB/c小鼠 C-NPs最初通過尾靜脈注射（i.v.）入小鼠體內，BLZ945分別在第0～4 d通過腹腔注射（i.p.）或瘤內注射（i.t.）。

高分子鍵合血管阻斷劑與納米藥物CB-NPs的體內抗腫瘤療效驗證：利用上述C26小鼠結腸癌腫瘤模型，當腫瘤生長至約410 mm3時，將小鼠隨機分為5組：⑴ PBS；⑵ BLZ945；⑶ C-NPs（30 mg/kg的CA4用量）；⑷ C-NPs（30 mg/kg的 CA4用量+ BLZ945（24 mg/kg腹腔注射））；⑸ CB-NPs（30 mg/kg的 CA4用量+24 mg/kg的BLZ945用量），每組5只BALB/c小鼠在t = 0，6 d進行給藥。

上述抑瘤評價利用游標卡尺測量腫瘤體積，通過測量腫瘤體積和小鼠體重，評估治療效果和藥物安全性，通過以下公式計算腫瘤體積（V）和腫瘤抑制率（TSR）：

其中：a和b分別表示使用游標卡尺測量的最長和最短腫瘤直徑；V0、Vx分別表示對照組和治療組的平均腫瘤體積。

當腫瘤體積超過2 000 mm3時，對小鼠實施安樂死。使用GraphPad Prism 8.0軟件進行結果分析。

1.9 測試與表征

使用德國Bruker公司AVANCE 300M核磁共振波譜儀測定核磁共振氫譜（1H-NMR）；傅里葉變換紅外圖譜（FT-IR）由Bio-Rad Win-IR紅外光譜儀測定；動態光散射（DLS）由WyattQELS儀器通過垂直偏振He-Ne激光在90°條件下進行檢測得到，測試的溫度為25 ℃；流式細胞儀為默克密理博公司的guava easyCyte 6-2L型；高效液相色譜使用Waters 1 525泵，Waters Symmetry? C18分析柱，Waters 2 489 UV/Visible detector檢測器，檢測波長為305 nm，流動相為乙腈-水（體積比為4∶1），流速為1.0 mL/min。

1.10 數據分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。所有實驗至少重復3次，結果表示為平均值±標準偏差（SD）或平均值±標準誤差（SEM）。使用one-way ANOVA分析含有多個組的數據之間的統計學差異，使用Student's t test分析了只有兩組的數據之間的統計學差異。* p ＜0.05被認為具有統計學意義，** p ＜0.01被認為具有高度統計學意義，*** p ＜0.001被認為具有極顯著統計學意義。

2 結果與討論

2.1 C-NPs的表征

PLG-g-mPEG的1H-NMR譜圖見圖3。圖中在化學位移3.55處的信號峰屬于PLG-g-mPEG的亞甲基質子（-CH2-CH2-O-，f）；C-NPs的1H-NMR 譜圖中，在化學位移 6.52（k），6.38（m）和 6.21（l）處的信號峰歸屬于C-NPs中CA4的質子，計算得到有51個谷氨酸鏈節鍵合上CA4，其載藥量（質量分數）為16.8%。GPC譜圖（圖 4（a））顯示聚合物的數均分子量: Mn（C-NPs）＞Mn（PLG-g-mPEG），證明 CA4 成功鍵合到 PLG-g-mPEG 上面。DLS 測得 C-NPs在水溶液中的流體力學半徑（Rh）為（49 ± 16） nm（圖 4（b））。

圖3 PLG-g-mPEG和C-NPs在重水-氘氧化鈉中的1H-NMR譜圖Fig. 3 1H-NMR spectra of PLG-g-mPEG and C-NPs in D2O-NaOD

2.2 BLZ945有效誘導M2型巨噬細胞凋亡

BLZ945對巨噬細胞的抑制增殖效果評價結果見圖5。首先，用IL-4刺激RAW264.7細胞使其分化為M2-TAMs。利用67 nmol/L的BLZ945處理RAW264.7細胞，RAW264.7細胞中Annexin V-FITC和PI陽性細胞的數量明顯增加（Q1區域的細胞為壞死細胞，也可能包含有少數晚期凋亡細胞以及機械損傷細胞；Q2區域為晚期凋亡的細胞；Q3區域為早期凋亡細胞；Q4區域為活細胞）（圖5（a）），表明BLZ945顯著誘導M2-TAMs的凋亡（圖5（b））。接著，用67 nmol/L的BLZ945對刺激分化后的RAW264.7細胞進行刺激處理并進行流式染色分析，從圖5（c）中觀察到F4/80和CD206雙陽性細胞（M2-TAMs）的明顯減少（Q1區域為CD206+F4/80-細胞，Q2區域為CD206+F4/80+細胞，Q3區域為F4/80+CD206-細胞，Q4區域為CD206-F4/80-細胞），證明BLZ945可以顯著降低M2-TAMs的比例（圖5（d））。以上數據表明BLZ945可以抑制M2-TAMs的增殖從而降低M2-TAMs的比例，有望對C-NPs治療后引起的免疫抑制微環境進行調控，從而增強血管阻斷劑納米藥物的抗腫瘤療效。

圖4 （a）PLG-g-mPEG 和 C-NPs的 GPC 譜圖；（b）C-NPs的 DLS 曲線Fig. 4 （a）GPC curves of PLG-g-mPEG and C-NPs；（b）DLS curve of C-NPs

圖5 BLZ945抑制細胞增殖：（a）流式細胞術分析BLZ945處理RAW264.7細胞12 h后的細胞凋亡；（b）定量分析藥物作用后凋亡的細胞比例（n=3）；（c）流式細胞術分析BLZ945處理后巨噬細胞上F4/80+CD206+的表達；（d）定量分析流式細胞術數據（n=3）Fig. 5 BLZ945 efficiently inhibited cell proliferation: （a）Cell apoptosis analysis of RAW264.7 cells after treated with BLZ945 for 12 h by flow cytometry; （b）The quantification analysis of the apoptotic cells after treatment（n = 3）; （c）Flow cytometry demonstrating expression of F4/80+CD206+ on the macrophages after BLZ945 treatment; （d）The quantification analysis of flow cytometry data（n = 3）

2.3 C-NPs與BLZ945聯合抗腫瘤療效評價

按圖6（a）的給藥方案在體內評價C-NPs和BLZ945聯合治療效果。如圖6（b）所示，C-NPs與不同給藥方式的BLZ945聯合治療對腫瘤體積的抑制效果均明顯優于C-NPs單一療法，有效減緩了腫瘤的生長。表1給出了由圖6（b）得到的腫瘤初始體積（V0）和治療第10 d時的體積（V10）以及TSR數據結果。給藥后第10 d，C-NPs與腹腔注射BLZ945或瘤內注射BLZ945聯合治療腫瘤抑制率分別達到55.6%和74.1%。圖6（c）顯示C-NPs治療后小鼠的體重略有下降，但一旦完成治療即可恢復正常，并且聯合治療組的小鼠體重與單獨治療組并無明顯差異。這些結果表明C-NPs與BLZ945具有協同治療效果，能夠顯著抑制腫瘤生長。

圖6 C-NPs與BLZ945在C26荷瘤BALB/c小鼠上的抗腫瘤聯合治療:（a）C26腫瘤模型的治療方案;藥物治療后（b）腫瘤體積和（c）體重變化Fig. 6 In vivo antitumor efficacy of C-NPs and BLZ945 on BALB/c mice bearing C26: （a）The treatment regimen of subcutaneous C26 tumor model; （b）Tumor volume and （c）change of body mass（n = 5） after drug treatment

表1 不同藥物治療起始腫瘤體積約為220 mm3的C26荷瘤小鼠10 d后的腫瘤抑制率Table 1 Tumor suppression rate in C26 tumor-bearing mice with initial tumor volume of 220 mm3 treated with different formulations on the tenth day

2.4 CB-NPs的表征

圖7 為 CB-NPs的1H-NMR 譜。譜圖中化學位移在 8.28（t）、7.91（s）、7.33（r）處的信號峰歸屬于 CB-NPs中BLZ945的苯環氫原子峰。另外，在圖8（a）CB-NPs的FT-IR譜圖中，1 591 cm-1處的特征峰對應于CB-NPs中BLZ945的C = N紅外拉伸振動。通過元素分析結果表明，CB-NPs中硫的總質量分數為0.674%，證明CBNPs的確鍵合上了BLZ945。以上數據證明了CB-NPs的成功制備。圖8（b）結果表明CB-NPs在水溶液中的流體力學半徑為（56 ± 19） nm，證明其可以在水中自組裝形成納米粒子；通過HPLC（圖8（c））測得的CB-NPs中CA4的載藥量為10.7%，BLZ945的載藥量為8.4%。

2.5 CB-NPs的體內抑瘤評價

圖9（a）為CB-NPs抗C26小鼠結腸癌腫瘤的給藥方案。如圖9（b）所示，與PBS組相比，小分子BLZ945以及C-NPs組的腫瘤生長都受到輕微抑制，單藥治療效果受限。在相同劑量下，C-NPs與BLZ945聯合治療組和上文結果一致，表現出一定的抑制腫瘤生長能力。CB-NPs提高了BLZ945靶向血管周圍M2-TAMs的能力，因此相比于與小分子BLZ945與C-NPs聯合組表現出明顯抑制腫瘤生長的能力。如表2所示，CB-NPs在給藥第10 d對初始體積約為410 mm3的腫瘤抑瘤率達到79%。圖9（c）進一步通過小鼠體重來評估藥物的全身毒性，從中可以看出，與PBS組相比，藥物治療組早期體重略微下降，治療結束后，由于腫瘤負荷的減小，小鼠體重逐漸恢復。以上結果表明，CB-NPs納米藥物提高了BLZ945的腫瘤靶向能力，減弱了CA4治療引起的腫瘤免疫抑制微環境，增強了其與CA4協同抑制腫瘤生長的能力。因此，CB-NPs納米藥物為血管阻斷劑治療實體瘤提供了一種有潛力的聯合治療策略。

圖7 CB-NPs在重水/氘氧化鈉/氘代二甲基亞砜中的1H-NMR譜圖Fig. 7 1H-NMR spectra of CB-NPs in D2O/NaOD /DMSO-d6

圖8 CB-NPs的表征：（a）PLG-g-mPEG、C-NPs和 CB-NPs的紅外光譜譜圖；（b）CB-NPs的 DLS 曲線；（c）CB-NPs以及CA4+BLZ945的HPLC譜圖Fig. 8 Characterization of CB-NPs: （a）FT-IR spectra of PLG-g-mPEG、C-NPs and CB-NPs; （b）DLS curve of CB-NPs; （c）HPLC spectra of CA4+BLZ945 and CB-NPs

圖9 CB-NPs在C26荷瘤BALB/c小鼠上的抗腫瘤治療：（a）C26腫瘤模型的治療方案;藥物治療后（b）腫瘤體積和（c）體重變化Fig. 9 In vivo antitumor efficacy of CB-NPs on BALB/c mice bearing C26: （a）The treatment regimen of subcutaneous C26 tumor model;（b）Tumor volume and （c）change of body mass after drug treatment

表2 不同藥物治療10 d后C26荷瘤小鼠的腫瘤抑制率Table 2 Tumor suppression rate in C26 tumor-bearing mice treated with different formulations on the tenth day

3 結 論

（1）BLZ945能夠誘導M2-TAMs凋亡，并選擇性降低M2-TAMs比例。

（2）血管阻斷劑納米藥物C-NPs與小分子BLZ945聯合治療，相比于單一治療組抗腫瘤療效提高。

（3）通過山口酯化方法制備了高分子鍵合CA4與BLZ945納米藥物CB-NPs。

（4）與單藥聯合組相比，CB-NPs納米藥物對初始體積較大的腫瘤生長具有更顯著的抑制效果。