兩種驅(qū)蟲方式對阿勒泰羊繁殖母羊體內(nèi)外寄生蟲的驅(qū)蟲效果及驅(qū)蟲后對腸道菌群的影響

鐘池，李鑫，舒展，陳卓，馮雷喜、馬義誠，趙紅瓊，郝智慧，姚剛*

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 新疆阿勒泰地區(qū)動物疾控中心，新疆 阿勒泰 836500；3. 中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，北京 100000)

家畜寄生蟲病是危害畜牧業(yè)生產(chǎn)的重要疾病。家畜寄生蟲病在防治上主要采用藥浴、投喂驅(qū)蟲藥、體表澆潑、注射等方式驅(qū)除體內(nèi)外寄生蟲[1]。伊維菌素是一種廣譜、高效、低毒的抗寄生蟲藥物，對體內(nèi)線蟲和體外節(jié)肢動物均有驅(qū)蟲活性，現(xiàn)已開發(fā)出多種獸醫(yī)臨床使用的制劑產(chǎn)品如注射劑、澆潑劑等，并廣泛用于防治多種動物的線蟲病和節(jié)肢動物寄生蟲病[2-3]。

人類和動物機體的腸道菌群(gut microbiota)與其宿主的健康關(guān)系密切，腸道菌群通過影響宿主的生長發(fā)育、生理功能、免疫和行為等來改變宿主的健康[4]。已有研究報道證明，寄生蟲等環(huán)境因素可影響宿主的腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)，反之亦然[5]。Knutie[6]對寄生飛絨蠅(Philornisdownsi)的加拉帕戈斯嘲鶇(Galapagosmockingbirds)和達爾文雀(Darwin’sfinches)雛鳥腸道菌群組成結(jié)構(gòu)進行了研究，發(fā)現(xiàn)飛絨蠅的寄生降低了加拉帕戈斯嘲鶇雛鳥的腸道菌群的生境內(nèi)多樣性。給新生工蜂感染Lotmariapassim原蟲后導致其腸道核心菌群組成發(fā)育不全[7]。Gilchrist等[8]研究發(fā)現(xiàn)，人體溶組織菌阿米巴(Entamoebiasishistolytica)感染后，腹瀉癥狀的發(fā)生與寄生蟲侵害加重和糞普氏菌(Prevotellacopri)的增加有關(guān)[8]。被線蟲感染的兔和被鞭蟲感染的小鼠，在感染急性期的腸道菌群 Alpha 多樣性顯著減少[9-11]。在靈長動物中，腸道寄生蟲(線蟲和美洲鉤蟲)的自然或?qū)嶒炐愿腥臼鼓c道菌群的 Alpha 多樣性普遍增加[12-14]。但郭歆巖[15]研究表明，腸道菌群的 Alpha 多樣性在寄生蟲感染后沒有改變。因此，腸道內(nèi)寄生蟲和與之共生的龐大腸道菌群可能有著錯綜復雜的關(guān)系，值得深入研究。對不同驅(qū)蟲劑型作用下，腸道菌群結(jié)構(gòu)是否會發(fā)生改變尚未有明確報道。本試驗采用伊維菌素澆潑劑和注射劑作為驅(qū)蟲藥，使用澆潑和注射兩種驅(qū)蟲方式對綿羊進行的驅(qū)蟲效果試驗，同時對兩種驅(qū)蟲方式作用下的腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化進行研究，探索兩種伊維菌素劑型是否會對腸道菌群結(jié)構(gòu)有影響，也籍此對兩種伊維菌素驅(qū)蟲劑的安全性提供胃腸功能方面的間接支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

取自阿勒泰地區(qū)某肉羊養(yǎng)殖合作社放牧加補飼的健康母羊75只，年齡為4～5歲，體重為(50.96±7.27)kg。

1.2 藥品與試劑

0.5%伊維菌素澆潑劑，1 mL含伊維菌素5 mg，每瓶 200 mL裝，中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院提供。主要成分為伊維菌素，藥物批號為20191216。

1%伊維菌素注射劑，1 mL含伊維菌素10 mg，每瓶200 mL裝，中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院提供，藥物批號為20191220。

糞便DNA提取試劑盒(Stool Genomic DNA Kit，50 preps)，貨號CW2092，生產(chǎn)日期為2018年9月，購自康為世紀生物科技有限公司。

1.3 試驗設(shè)計與分組處理

通過篩選的阿勒泰大尾羊75只，隨機分為3組，注射驅(qū)蟲組、澆潑驅(qū)蟲組和不驅(qū)蟲對照組，每組25只。不驅(qū)蟲對照組(Ctr)不進行用藥；注射驅(qū)蟲組(Inj)劑量按 0.02 mL/kg，皮下一次注射給藥；澆潑驅(qū)蟲組(Spi)劑量按 0.1 mL/kg，羊背部澆潑一次給藥。分別于用藥前(第0天)和用藥后(第21天)觀察檢查體表寄生蟲，測定羊體溫、呼吸、脈搏等生命體征，并采集糞便。糞便采集2份，分別用于觀察體內(nèi)蟲卵(低溫保存)和高通量測序(采集的糞便液氮速凍帶回實驗室保存)。

1.4 指標測定

1.4.1 生理指標測定

體溫測定：采用電子數(shù)字溫度計將溫度計置于羊后肢股內(nèi)側(cè)并讀數(shù)，或者獸用紅外測溫儀測量，獸用紅外線測溫儀測定羊的體溫3～5 s，測3次取平均值；

呼吸測定：通過觀察羊胸腹部的起伏動作測定，秒表記錄每分鐘呼吸次數(shù)；

脈搏測定：通過觸壓后肢股內(nèi)側(cè)部股動脈，秒表記錄每分鐘脈次數(shù)。

呼吸、脈搏秒表計數(shù)15 s，測定3次，取平均值，算出每分鐘呼吸、脈搏數(shù)。

1.4.2 體表寄生蟲檢查

疥螨、癢螨和蜱蟲的采樣方法參照文獻[16]進行采集，檢查方法參照文獻[17]進行。虱子的采樣和檢查鑒定方法參照文獻[18]進行。

1.4.3 體內(nèi)線蟲卵檢查

采用麥克馬斯特氏法進行蟲卵計數(shù)。按照楊希菊[19]的方法制備飽和鹽水 (100 mL水加食鹽 35～40 g) 1 L于錐形瓶中，從糞便不同的部位挑起 2 g的糞便塊，加入飽和鹽水 58 mL，將糞便充分震蕩搗碎，與鹽水攪勻，使成均勻糞液[19]。用吸管吸取糞汁注入麥氏計數(shù)室中，靜置 1～2 min，然后再鏡下計數(shù) 1 cm2方格內(nèi)的蟲卵總數(shù)，求出兩個刻度室中的蟲卵平均數(shù)，乘以200即為每克糞便蟲卵數(shù)(EPG)。

1.4.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便樣品中DNA，操作步驟按照說明書和文獻[20]等所述方法進行。

采用16S rDNA序列擴增、測序、分析。測序分析由深圳微生太科技有限公司完成。按照流程操作準備樣品，提取糞便DNA，然后進行PCR擴增。以能夠反映菌群組成和多樣性的目標序列為靶點，根據(jù)序列中的保守區(qū)域設(shè)計相應引物，并在添加測序時區(qū)分不同樣本的標簽序列(Barcode)，進而對rRNA基因可變區(qū)(單個或連續(xù)的多個)或特定基因片段進行PCR擴增。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。最后上機進行高通量測序，由于MiSeq測序讀長較短的特性，同時也為了保證測序質(zhì)量，設(shè)定目標片段的測序長度為 200～450 bp。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對腸道菌群物種操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)進行豐度、維恩(Venn)圖、Alpha多樣性、Beta多樣性等分析。所測數(shù)據(jù)用平均值±標準差(Mean±SD)表示，采用統(tǒng)計分析軟件GraphPad Prism 8.0.1進行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)外驅(qū)蟲情況

在驅(qū)蟲第0天和驅(qū)蟲第21天，對各試驗組羊體表寄生蟲和體內(nèi)蟲卵統(tǒng)計計數(shù)。結(jié)果表明，經(jīng)注射、澆潑方式驅(qū)蟲后對體內(nèi)線蟲卵、體外寄生蟲總數(shù)較驅(qū)蟲前具有極顯著差異(P<0.01)，驅(qū)蟲效果明顯(表1)。

表1 各試驗組羊在使用藥物前后體外寄生蟲總數(shù)和體內(nèi)蟲卵情況統(tǒng)計

2.2 生理指標測定結(jié)果

對各試驗組羊的體溫、呼吸和脈博次數(shù)測定結(jié)果如表2所示。2個驅(qū)蟲組與對照組間體溫、呼吸和脈搏數(shù)值均無顯著差異(P>0.05)。

表2 各試驗組羊生命體征測定結(jié)果

2.3 腸道菌群測定結(jié)果

2.3.1 腸道微生物物種組成分析

2.3.1.1 腸道菌群OTU組成Venn分析

基于腸道菌群物種操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)進行Venn法初步分析，結(jié)果如圖1所示。Ctr、Inj和Spi 3組共有的OTU為42個，Ctr組特有OTU為517個，Inj組特有OTU為561個，Spi組特有OTU為655個(圖1)。

圖1 各組羊腸道微生物共有OTUs的數(shù)量Venn圖

2.3.1.2 差異物種Lefse分析

根據(jù)差異物種Lefse分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)梭菌科(Clostridiaceae)和梭菌屬(Clostridium)為Ctr組綿羊腸道菌群的差異表達特征菌屬。Ctr組中該菌屬平均相對豐度為0.01%，而經(jīng)Inj和Spi方法驅(qū)蟲處理后，腸道菌群中沒有檢測到梭菌科(Clostridiaceae)和梭菌屬(Clostridium)的菌屬存在(圖2)。LDA值分布柱狀圖(顯著差異物種影響程度)顯示出梭菌科、梭菌屬為Ctr組的差異物種。

圖2 LEfSe分析進化分支圖和差異物種影響

2.3.1.3 門和屬水平菌群豐度及物種組成

在3個試驗組羊的腸道菌群門水平上，共檢出15個菌門，如圖3A所示。相對豐度大于等于0.1% 的菌門有8個，這8個門水平的細菌是這3個組羊中的核心菌群。相對豐度大于等于10% 的菌門有2個，它們分別為擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)，是這3個組羊的優(yōu)勢菌群。將2個驅(qū)蟲組與不驅(qū)蟲的對照組比較，結(jié)果見表3。3個試驗組門水平OTU相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

注：未譯中文的英文菌名，暫無合適中文譯名

表3 各組羊腸道菌群中相對豐度最高的15個門

在腸道菌群屬水平上，共檢出92個菌屬，并對前20的菌屬(共包含了90% 以上的相對豐度)進行了統(tǒng)計制圖(圖3B)。在圖3B中大于10% 的2個菌屬分別為疣微菌科未明確分類的屬(Unspecified_Ruminococcaceae)和擬桿菌目未明確分類的屬(Unspecified_Bacteroidales)，它們是3個試驗組羊的優(yōu)勢菌群。將不同驅(qū)蟲方式的2個組與不驅(qū)蟲對照組比較，結(jié)果顯示(表4)，屬水平OTU相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

表4 各組羊腸道菌群中相對豐度最高的20個屬

2.3.2 Alpha多樣性分析

如表5所示，注射驅(qū)蟲組、澆潑驅(qū)蟲組觀測到的群落豐富度指數(shù)(Chao1)、群落多樣性指數(shù)(Shannon)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)(Faith’s_pd)，均無顯著差異(P>0.05)。

表5 Alpha多樣性指數(shù)分析

2.3.3 Beta多樣性

通過不同樣品間的微生物群落構(gòu)成進行比較，主坐標分析(PCoA)顯示，不同驅(qū)蟲模式下的樣品聚集在一起，微生物群落結(jié)構(gòu)相似度高(圖4A)。非度量多維尺度分析(NMDS)中樣本間距離與主坐標分析結(jié)果類似，微生物群落結(jié)構(gòu)相似度高(圖4B)。Permanova檢驗分析表明(表6)，不同驅(qū)蟲模式作用下菌群結(jié)構(gòu)無顯著差(P>0.05)。

注：括號中百分比表示對應坐標軸所解釋的樣本差異數(shù)據(jù)比例

表6 Permanova檢驗

3 討論

本次驅(qū)蟲試驗采用了伊維菌素注射和澆潑兩種驅(qū)蟲方式，均對綿羊的體外寄生蟲驅(qū)蟲效果明顯。消化道蟲卵檢測結(jié)果也表明，兩種方式對體內(nèi)寄生蟲蟲卵數(shù)也有一定的驅(qū)除作用。本試驗與王文龍等[21]的澆潑、注射方法一樣，結(jié)果也一致；同時與魏彩艷[22]伊維菌素澆潑結(jié)果也一致。

人和動物的腸道內(nèi)有數(shù)以萬計的微生物，包括細菌、古生菌、病毒和真菌等，其中數(shù)量最多的是細菌。這些微生物與宿主共代謝、共進化，形成互惠共利的復雜關(guān)系。腸道菌群能為機體提供營養(yǎng)和能量、調(diào)節(jié)免疫、頡抗病原微生物、參與代謝，甚至能影響宿主的行為[23-24]。機體的腸道菌群受遺傳因素、飲食和環(huán)境(如使用驅(qū)蟲藥)等多因素的影響。這種共生關(guān)系可能會因為疾病而被破壞，諸如寄生蟲感染能夠影響宿主腸道菌群組成，進而影響宿主健康；而腸道菌群也能夠影響寄生蟲的活力與感染力[25]。有研究表明在腸道微生物與寄生蟲相互作用，腸道菌群的穩(wěn)定是宿主健康的關(guān)鍵因素之一[26]。Coyte等[27]發(fā)現(xiàn)，蛔蟲的感染會對宿主造成嚴重的營養(yǎng)不良，損害了宿主的認知、記憶等功能，同時也引起腸道菌群發(fā)生變化，與感染寄生蟲的糞樣相比較，未感染寄生蟲的糞樣顯示出腸道菌群物種的豐度更高。寄生蟲和腸道菌群間的作用是相互的，通過改變腸道菌群的組成可能增加黏膜部位對寄生蟲感染的抵抗力，并提升宿主對這些寄生蟲的全身免疫能力[28]。分析人類感染寄生蟲過程中腸道微生物的特定成分中發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌(Bifidobacterium)和鏈球菌(Streptococcus)豐度較高的宿主對惡性瘧原蟲的抗感染能力更高[29]。在胃腸道寄生蟲入侵后，急性發(fā)作的炎癥是伴隨著初始腸道菌群Alpha多樣性減少，并且隨著慢性感染的建立而恢復[30-31]。

目前研究表明，抗生素藥物大量應用于多種疾病的治療，同時可能會導致腸道微生物群生態(tài)失調(diào)，多樣性發(fā)生改變等[32]。試驗證實小鼠飼喂萬古霉素、新霉素等抗生素后腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，多樣性指數(shù)(Chao 1，Shannon，Simpson)均顯著下降[33]。本試驗腸道菌群測定結(jié)果表明，經(jīng)兩種驅(qū)蟲方法處理后，綿羊腸道菌群結(jié)構(gòu)整體沒有被影響，不同驅(qū)蟲方式屬水平OTU相對豐度無顯著差異，Alpha多樣性分析顯示均無顯著差異，Beta多樣性分析顯示，不同驅(qū)蟲模式作用下菌群結(jié)構(gòu)無顯著差異。這可能與本文試驗所用藥物與前述研究不同、給藥方式不同和用藥濃度較低，澆潑和注射給藥并未直接接觸動物消化道等因素有關(guān)。另外，鄭舟琴等[34]在分析抗生素對小鼠糖代謝及腸道菌群的影響試驗中，每周對小鼠糞便做16S rDNA基因測序分析，發(fā)現(xiàn)抗生素組較對照組腸道菌群Shannon指數(shù)顯著下降。萬有娣等[33]在試驗中發(fā)現(xiàn)，其中一組感染第9天時，小鼠腸道菌群和微生物代謝已基本恢復。而本試驗結(jié)果的觀察測定時間為驅(qū)蟲后第21天，顯著長于上述文獻的第9天，也可能是未發(fā)現(xiàn)腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著變化的另一個原因。

梭菌屬是一群革蘭陽性菌，能產(chǎn)生芽胞，對外界抵抗力強。其廣泛分布于環(huán)境、人和動物腸道中，該屬中有許多種可產(chǎn)生外毒素的致病菌，對人和動物產(chǎn)生危害，其常見致病厭氧芽胞梭菌主要有破傷風梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌和艱難梭菌(Clostridiumdifficile)等。研究表明，纖維攝入量過低均可能形成有利于梭狀芽胞桿菌生長的腸道環(huán)境，從而增加梭狀芽孢桿菌感染導致結(jié)直腸癌發(fā)生的風險[35-36]。調(diào)節(jié)腸道的微生物群的平衡，可以抑制梭狀芽孢桿菌的生長，從而達到降低結(jié)直腸癌風險[37]。本試驗根據(jù)物種差異Lefse分析發(fā)現(xiàn)，梭菌科和梭狀屬為不驅(qū)蟲對照組中的優(yōu)勢差異菌屬，顯著高于經(jīng)兩種驅(qū)蟲方式驅(qū)蟲的給藥組。兩種驅(qū)蟲方式降低了梭菌科和梭狀屬的相對豐度可能對于其腸道菌群結(jié)構(gòu)的改善有益。

本試驗采用伊維菌素的兩種劑型的驅(qū)蟲方式均顯示良好效果，且對出宿主腸道菌群整體組成結(jié)構(gòu)幾無影響，而梭菌科、梭菌屬相對豐度的顯著下降可能對動物健康有益。兩種驅(qū)蟲方式未對綿羊正常生理功能造成不利影響，也間接支持其安全性較好。