液泡膜陽離子轉運蛋白在植物抗逆過程中的功能研究進展

高天歌 馬翠敏 王鎖民

摘要 液泡是細胞內一種可以儲存多種營養物質以及代謝產物的細胞器。為了抵御高鹽、干旱和重金屬毒害等非生物脅迫，植物可以通過將細胞質中過量積累的Na+、K+、Ca2+和其他金屬陽離子區域化至液泡中，以此來維持正常的細胞膨壓并提高植物的抗逆性。液泡膜陽離子轉運蛋白種類豐富，能夠調控細胞中不同無機離子的轉運和區域化。鑒于此，對定位于液泡膜的不同陽離子轉運蛋白在植物響應逆境脅迫中的作用進行了簡要概述。

關鍵詞 液泡膜轉運蛋白;陽離子;抗逆性;功能

中圖分類號 Q945 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）21-0001-05

Abstract Vacuole is a kind of organelles that can store a variety of nutrients and metabolites in cells.In order to resist the harsh environments such as salinization， drought and heavy metal pollution， plants can change the turgor and improve its stress resistance by compartmentalizing the excess ions， such as Na+， K+， Ca2+ and other metal cations， in the cytoplasm into vacuoles.There are many tonoplastcation transporters regulated the transport and compartmentalization of different ions.In view of this， we mainly summarized the roles of different tonoplast cation transporters in plants responding to stresses in this review.

Key words Tonoplast transporters;Cation;Stress tolerance;Function

逆境脅迫是對植物生長發育造成不利影響的各種環境因素的總稱，可分為生物脅迫和非生物脅迫[1]。其中，非生物脅迫是限制農作物產量和野生植物物種分布的主要因素，包括干旱、土壤鹽漬化、低溫、高溫以及重金屬毒害等[2]。在長期的進化過程中，植物形成了各種響應機制來抵御非生物脅迫，其中一種有效的應對策略是植物細胞通過將細胞質中過量的離子區域化至液泡中來維持其正常的膨壓，從而提高植物的抗逆性[3-4]。在此過程中，定位于液泡膜上的負責調控胞內物質特異性識別和運輸的轉運蛋白發揮了重要的作用[5-6]。根據結構與作用機制的不同，大致將其分為3類：質子泵、通道蛋白以及共轉運蛋白[7]。近年來，有關定位于液泡膜的各類陽離子共轉運蛋白的結構和功能的研究受到了眾多學者的廣泛關注，且研究多集中于調控Na+、K+區域化的液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白（tonoplast Na+/H+antiporter，NHX）、調控Ca2+區域化的液泡膜Ca2+/H+反向轉運蛋白（Ca2+/H+ exchanger，CAX）以及部分負責轉運Cd2+、Zn2+、Mn2+和Fe2+等金屬陽離子的轉運蛋白。鑒于此，筆者重點對上述幾類液泡膜陽離子轉運蛋白的結構及其在植物抗逆過程中的作用進行概述，以期為進一步研究植物的抗逆機理以及提高農作物和優良牧草的抗逆性提供借鑒。

1 植物液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白（NHX）

鈉（Na）是地殼中含量排名第六的元素，約占其總量的2.8%，同時也是海水中含量僅次于氯（Cl）的第二大元素[8]。Na在植物的生命活動過程中起到了重要作用，作為一種有益元素，其主要以Na+形式被吸收[9]。對于大多數植物而言，低濃度的Na+可以促進其生長，減輕植物由于營養不良而產生的癥狀，甚至適量的Na+還可以改善作物的品質與口感[10-11]。然而，在高鹽條件下，土壤中過量的Na+則會導致大多數陸生植物的生命活動受到抑制，表現出中度甚至重度的Na+毒害癥狀[12]。而NHX作為一種重要的耐鹽決定因子，可以介導細胞質中過多的Na+、K+區域化至液泡作為廉價的滲透調節物質，同時減少過量的Na+對細胞質中的代謝活動產生毒害作用[13]，從而在調節細胞滲透勢與維持膨壓，促進植株吸水以及提高植物耐鹽、抗旱性等方面發揮十分重要的作用[14]。

1.1 NHX的結構

在高等植物中，最早是在紅甜菜（Beta vulgaris）貯藏組織的液泡膜上檢測到了Na+/H+轉運活性[15]。之后，Gaxiola等[16]首次從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆出了液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白基因AtNHX1。自此，人們對于高等植物NHXs的研究也逐漸展開。目前，研究者分別從小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、冰葉日中花（Mesembryanthemum crystallinum）、鹽地堿蓬（Suaeda salsa）和霸王（Zygophyllum xanthoxylum）等植物中克隆得到NHX基因[17-21]。

研究表明，NHX是一種分子量為35 000～70 000 kDa的蛋白，一般其C末端由300多個氨基酸組成，且含有多個蛋白激酶作用位點，而N端則是由550多個氨基酸構成的10～12個跨膜區域（transmembrane domain，TM）[22]。通過分析AtNHX1的拓撲學結構，研究者發現AtNHX1共包含有12個跨膜域以及1個具有親水性的C末端，且基本上都位于液泡腔中;而N末端則朝向胞質，同時在其第3個跨膜域上包含一個高度保守的氨氯吡嗪脒（amiloride）結合位點[23]。根據序列類型，NHX可分為兩類，即Class-I NHX與Class-Ⅱ NHX;Class-Ⅱ NHX是在裸子、被子和苔蘚植物中發現的，經證實其位于核內體上;而Class-I NHX則普遍存在于陸生植物的液泡膜上并具有特定的功能，擬南芥AtNHX1-AtNHX4就屬于該亞型[24]。

1.2 NHX在植物抗逆過程中的作用

與野生型相比，過表達擬南芥AtNHX1的轉基因番茄（Solanum lycopersicum）[25]和轉基因油菜（Brassica napus）[26]的生長均未受到200 mmol/L NaCl處理的明顯抑制。Zeng等[27]研究顯示在水稻中過表達菊芋（Helianthus tuberosus）HtNHX1和HtNHX2能夠提高轉基因植株的抗鹽能力。在鹽處理下，與野生型相比，共表達霸王ZxNHX和ZxVP1-1（液泡膜H+-焦磷酸酶編碼基因）的轉基因紫花苜蓿（Medicago sativa）能夠在葉片中積累更多的Na+、K+和Ca2+，以此來緩解鹽脅迫對植物產生的不利影響[28]。以上研究表明，NHX1在植物響應鹽脅迫的過程中起到了不可替代的作用，過表達NHX1可以在一定程度上提高植物的耐鹽性[28-30]。除NHX1外，定位于液泡膜上的NHX2在植物抗逆過程中也發揮了關鍵的作用。在200 mmol/L NaCl的鹽脅迫下，過表達小麥TaNHX2的轉基因茄子（Solanum melongena）葉片的生長明顯優于野生型，且其Na+、K+含量均較野生型顯著增加，表明TaNHX2在轉基因茄子耐鹽性的響應過程中起著重要的調控作用，因此TaNHX2也可以作為改善作物耐鹽性的候選基因之一[30]。杜梨（Pyrusbetulaefolia）PbrNHX2的表達水平受鹽脅迫和脫水的誘導，但不受冷害的影響;在煙草（Nicotiana tabacum）中過表達PbrNHX2，發現其可通過調節活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平來增強轉基因煙草抵御鹽脅迫的能力[31]。此外，在正常條件下，定位于液泡膜的NHX3和NHX4對植物生長發育的影響雖然較NHX1和NHX2小，但是二者在離子轉運方面仍具有自身的獨特性，如AtNHX4對Na+、K+都具有轉運能力且更偏向于轉運K+，而AtNHX3則只轉運Na+、不參與轉運K+[32]。

除鹽脅迫外，干旱也是嚴重影響植物生長發育的非生物脅迫之一[33]。霸王主要分布于我國西北荒漠地區，具有超強的抗旱性[34]。在干旱脅迫下，ZxNHX能夠將細胞質中的Na+區域化至液泡，以降低細胞滲透勢，從而使植物適應干旱環境[20]。研究表明，干旱處理下，共轉化ZxNHX和ZxVP1-1的轉基因紫花苜蓿的株高、根長和干重分別較野生型顯著增加28.7%、67.7%和47.5%，且其葉片中的Na+、K+和Ca2+含量分別較野生型上升130.8%、81.7%和100.0%，表明共轉化ZxNHX和ZxVP1-1可以顯著提高植物的抗旱性[35]。在甜菜中過表達ZxNHX和ZxVP1-1可以使轉基因植株地上部的Na+含量增加1.2～1.5倍，貯藏根中的蔗糖含量增加6%～16%，從而增加轉基因甜菜對干旱的抵御能力[36]。除霸王外，有研究表明，在大麥（Hordeum vulgare）中過表達鹽生草（Halogeton glomeratus）HgNHX1，不僅可以顯著提高轉基因大麥的耐鹽性，還可以使其維持較高的水分代謝能力，具有更強的抗旱性[37]。

2 植物液泡膜Ca2+/H+反向轉運蛋白（CAX）

鈣（Ca）是維持植物生長發育所必需的大量元素之一，在植物生命進程中具有不可或缺的作用[38]。Ca2+不僅是細胞結構的組成成分和多種酶的輔助因子，而且還是細胞內重要的第二信使[39]。Ca2+可參與調控植物的生長發育，在其抗病和適應逆境的過程中具有重要作用，不僅如此，Ca2+還可以與鈣調素（calmodulin，CaM）結合形成活化的Ca2+-CaM復合體，參與細胞內的信號轉導[40-42]。植物體內的Ca2+通常處于動態平衡狀態，Ca2+缺乏會導致葉片壞死，甚至引起植株的死亡;而Ca2+濃度過高則會造成離子毒害[43]。植物能夠通過Ca2+轉運系統調節其體內Ca2+的穩態平衡，其中液泡膜Ca2+/H+反向轉運蛋白（CAX）能夠將胞質中的Ca2+區域化至液泡內，從而對細胞內的Ca2+濃度起到調控作用[44]。

2.1 CAX的結構

CAX是由11個跨膜域組成的跨膜蛋白，其N末端位于胞質內，C末端則位于液泡中，并且N末端的親水性區域可能會與激酶等信號蛋白相互作用以調節CAX發揮功能[44-45]。CAX的11個跨膜域可分為TM1、TM2-6和TM7-11共3個部分，其中TM1與陽離子的轉運相關[46]。CAX具有4個功能域，分別為參與調控Ca2+/H+反向轉運活性的N-末端自抑制區域（N-terminal regulatory region，NRR）[47-49]、決定Ca2+轉運能力的Ca功能域（Ca2+ domain，CaD）[50]、與Mn2+的專一性相關的C功能域[51]、與細胞質pH調節相關的D功能域[52]。研究發現，擬南芥AtCAX1～AtCAX4均定位于細胞的液泡膜上[39]。

2.2 CAX在植物抗逆過程中的作用

許多研究表明，CAX在植物抵御非生物脅迫特別是鹽脅迫的過程中發揮了重要的作用，CAX活性的改變會影響植物中由鹽脅迫誘導的Ca2+信號的變化，進而影響植物對鹽脅迫的耐受能力[53]。鹽脅迫對CAX3的表達具有很強的誘導作用，但對CAX1表達的誘導則很微弱[39]。Zhao等[54]將擬南芥cax1和cax3單突株系以及cax1/cax3雙突株系分別在含有50和100 mmol/L NaCl的介質中進行培養，發現cax3和cax1/cax3對鹽具有較強的敏感性，而cax1則對鹽的敏感性不明顯;進一步的生化分析顯示，cax3對鹽的敏感性與鹽脅迫下液泡膜Ca2+/H+轉運活性以及質膜H+-ATPase活性密切相關，表明CAX3在植物響應鹽脅迫的過程中發揮了重要的作用。此外，AtCAX1和AtCAX3可以協同發揮作用，二者的共表達能夠顯著提高Ca2+敏感型酵母K667的耐鹽性[55]。除了AtCAXs，鹽地堿蓬等其他植物的CAXs對于抵御鹽脅迫也具有一定的作用，例如在擬南芥中超表達鹽地堿蓬SsCAX1同樣能夠增強轉基因植株對鹽脅迫的耐受性[56]。此外，擬南芥AtCAX2、AtCAX4以及一些其他植物的CAXs還能參與調控除Ca2+外的其他金屬陽離子的轉運。

CAX在植物響應冷脅迫的過程中也發揮了重要的作用。cax1-1、cax1-2、cax1-3和cax1-4分別是4個AtCAX1的T-DNA插入突變株系，其中cax1-3和cax1-4在經過低溫馴化后，其在不同低溫處理下的存活率均顯著高于野生型，表明AtCAX1能夠參與調控擬南芥對低溫的響應[57]。

3 其他陽離子液泡膜轉運蛋白

錳（Mn）、鋅（Zn）、鐵（Fe）是植物生長發育所必需的3種微量元素，然而當細胞內這些金屬離子的含量超過一定范圍后也會對植物造成不可避免的傷害[58]。另外，鎘（Cd）作為最常見的重金屬之一，具有易被植物吸收的特點，并且過高濃度的Cd2+會對植物的生長發育造成損傷[59]。有研究表明，液泡膜上存在多種能夠參與金屬離子轉運和區域化的轉運蛋白，均可以起到緩解上述金屬離子毒害以及維持植物生長發育的作用[60]，主要包括CAX家族轉運蛋白、陽離子擴散輔助蛋白（cation diffusion facilitator，CDF）、自然抵抗相關巨噬細胞蛋白（natural resistance-associated macrophage protein，NRAMP）以及植物鋅鐵轉運蛋白（zinc-regulated transporters，iron regulated transporter-like proteins，ZIP）等[61-62]。

3.1 轉運其他金屬離子的CAX

CAX不僅在植物Ca2+的轉運中發揮重要作用，而且對植物抵御Cd2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+和Ba2+等金屬離子毒害來說也是必不可少的。Shigaki等[52]研究發現擬南芥CAX1的一種突變體CAXcd，其可以將Cd2+區域化在酵母液泡內。Wu等[63]將CAXcd在矮牽牛（Petunia hybrida）中進行超表達，在50和100 μmol/L CdCl2處理36 d后，表達CAXcd的矮牽牛植株的長勢明顯好于野生型，且其能夠在體內積累更多的Cd2+;同時研究還發現過表達CAXcd的矮牽牛植株從開花到種子成熟，植株的形態和生長發育并未受到其體內大量積累的Cd2+的明顯影響。而在煙草（Nicotiana tabacum）中超表達AtCAX2還可以增加Mn2+在液泡中的積累[64]。Koren′kov等[65-66]研究發現AtCAX2和AtCAX4均可以將轉基因煙草細胞質中的Cd2+、Zn2+和Mn2+區域化到液泡中，以緩解上述金屬離子對植物造成的毒害。此外，研究發現CAX還可以參與細胞質中Ni2+和Ba2+的轉運。庭薺屬植物Alyssum lesbiacum的AlCAX 定位于液泡膜上，可參與Ni2+的轉運與區域化，進而改變A. lesbiacum對Ni2+的耐受性[67]。而Liu等[68]將小花堿茅（Puccinellia tenuiflora）的PutCAX1在Ca2+敏感型酵母K667中進行超表達，可使酵母對Ba2+有一定的耐受能力。

3.2 CDF家族轉運蛋白

CDF轉運蛋白主要負責調控金屬陽離子從胞質到胞外或細胞器的轉運[62]，該家族蛋白按照系統進化關系可以分為3類，即Zn-CDFs、Fe/Zn-CDFs和Mn-CDFs轉運蛋白[6]。目前，研究者已鑒定出許多CDF家族蛋白，通過生物信息學分析發現，該家族蛋白普遍具有6個跨膜域，在N端的第1和第2個跨膜域之間存在一個高度保守的特征序列，在C末端則存在一個特殊的陽離子外排結構域[69]。金屬耐受性蛋白（metal tolerance proteins，MTP）是CDFs家族成員之一，研究表明，擬南芥AtMTP定位在液泡膜上，主要調控胞質中的Zn2+向液泡的區域化[70-71]。此外，水稻的OsMTP8.1和OsMTP8.2都是定位于液泡膜的陽離子轉運蛋白，在高Mn2+條件下，OsMTP8.1缺失會導致水稻葉綠素含量下降，生長受限，證明OsMTP8.1是Mn2+特異性轉運蛋白;而且OsMTP8.1還可以與OsMTP8.2協同發揮作用，將過量Mn2+區域化在水稻根系和幼苗的液泡中，以減少高Mn2+脅迫對水稻產生的毒害[72-73]。

3.3 NRAMP家族轉運蛋白

NRAMP同樣是一類重要的金屬離子轉運蛋白，能夠參與多種二價金屬離子的吸收和轉運[6]。生物信息學分析顯示，NRAMP蛋白普遍由12個跨膜結構域組成，其中第1～10個跨膜域具有疏水性，并且在第8和第9個跨膜域上還存在一個高度保守的“共有轉運標簽”序列基元，推測這段高度保守的序列可能與NRAMP蛋白的功能密切相關[74]。目前已在擬南芥和東南景天（Sedum alfredii）等植物中鑒定出了NRAMP轉運蛋白，研究發現SaNRAMP3定位于液泡膜上，對Cd2+、Mn2+、Fe2+等都具有轉運功能[75]。在擬南芥中，AtNRAMP3和AtNRAMP4同樣定位于液泡膜，主要調控Mn2+和Fe2+的轉運;AtNRAMP3和AtNRAMP4可以將液泡中的Mn2+運輸至葉肉細胞的葉綠體中，且二者之間存在功能冗余[76];此外，AtNramp3 AtNramp4缺失突變株系還會因Fe2+缺乏而表現出白化以及種子不能萌發等現象[77]。

3.4 ZIP家族轉運蛋白

ZIP是一類多次跨膜轉運蛋白，能夠吸收和運輸二價金屬離子，在維持植物體內Zn2+、Fe2+平衡的過程中起重要作用[78]。ZIP家族轉運蛋白由326～425個氨基酸組成，普遍含有6～9個跨膜域：其中N末端位于細胞內側，包含3～4個跨膜域，而C末端則位于細胞外側，包含3～5個跨膜域;此外，在第3和第4個跨膜域之間還存在一個富含組氨酸殘基的可變區，推測該區域可能與其能夠參與調控金屬離子的轉運有關[79]。ZIP蛋白具有較多的疏水基團，有利于其與膜的結合，而這些結合在膜上的蛋白可以參與調控Zn2+、Fe2+的跨膜轉運[80]。有研究發現，擬南芥AtZIP1定位于液泡膜，主要負責調控液泡Zn2+的外排，也可能參與根中Zn2+從液泡釋放到細胞質的再活化過程[81]。在木薯（Manihot esculenta）中共表達擬南芥AtMTP1和AtZIP1能夠顯著提高貯藏根可食用部分的Zn2+含量，但是Zn2+的過量積累也會導致轉基因植株矮小和葉片失綠等不良表型[82]。

4 總結與展望

干旱、土壤鹽漬化以及金屬離子毒害等非生物脅迫嚴重影響了我國農牧業的發展和生態環境的恢復。植物細胞中定位于液泡膜上的陽離子轉運蛋白可以將細胞質中過量的Na+、K+、Ca2+和一些其他金屬陽離子區域化至液泡中，一方面能夠調節細胞的滲透勢、促進水分的吸收，維持植物的正常生長;另一方面還可以緩解植物受外界環境影響所產生的離子毒害。因此，闡明液泡膜陽離子轉運蛋白在植物抗逆中的作用，挖掘更多可利用的關鍵基因，對培育耐鹽、抗旱作物新品種以及生態環境的恢復治理都具有十分重要的意義。目前，關于液泡膜陽離子轉運蛋白的研究多集中于能夠區域化Na+、K+的NHXs以及轉運Ca2+的CAXs，并且對二者響應逆境脅迫的機制也有了一定的進展。但是，對定位于液泡膜上的其他陽離子轉運蛋白功能的研究相對還不夠深入。基于以上現狀，今后的研究可從以下3個方面入手：①除一些常見的Na+/H+和Ca2+/H+逆向轉運蛋白外，有關轉運Cd2+、Zn2+、Mn2+和Fe2+等金屬陽離子的液泡膜轉運蛋白的挖掘及其作用機制的研究還需進一步完善;②加強對各類陽離子轉運蛋白之間協同作用的研究，以期建立相對完善的細胞質陽離子轉運體系;③可以通過比較不同物種間的某個特定液泡膜陽離子轉運蛋白與其抗逆性的關系，篩選可能導致這種差異的天然變異位點，為今后農作物及牧草的改良提供優異基因資源。

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