礦區排土場復墾區玉米根際土壤真菌遺傳多樣性研究

劉寶勇 王麗莎 常敬華

摘要 [目的]研究礦區排土場復墾區和普通種植區土壤真菌多樣性的差異。[方法]以阜新海州露天礦排土場復墾區玉米田土壤（K1區）、阜新市太平區下洼子村玉米田土壤（F1區）為研究對象，分析土壤的理化性質并利用基因組測序分析復墾區和對照區真菌多樣性的差異。在此基礎上，對復墾區和對照區樣本中的真菌進行分離、純化和分子鑒定，并分析可培養真菌的多樣性。[結果]K1區和F1區土壤有效磷、速效鉀、pH呈顯著性差異，堿解氮和有機質呈非顯著性差異;K1區的物種豐富度和均勻度均低于F1區，K1區鑒定出19個真菌屬，而F1區共鑒定出52個真菌屬，真菌的預測功能K1區比F1區少11種;K1區分離鑒定的真菌以青霉屬（Penicillium sp.）、鐮刀菌屬（Fusarium sp.）真菌為主，F1區分離鑒定的真菌以青霉屬（Penicillium sp.）和木霉屬（Trichoderma sp.）真菌為主。[結論]該研究為礦區生態修復、土壤改良提供理論依據和實踐指導。

關鍵詞 排土場復墾區;理化性質;真菌多樣性;土壤改良

中圖分類號 S154.3 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）21-0063-07

Abstract [Objective]To study the differences in soil fungal diversity in the mining areas wasteland reclamation area and ordinary planting area.[Method]Taking the cornfield soil （K1 area） in the reclamation area of Fuxin Haizhou openpit mine dumping field and the cornfield soil （F1 area） in Xiawazi Village，Taiping District，Fuxin City as the research objects，the physical and chemical properties of the soil were analyzed and the differences in fungal diversity in the reclamation and control areas were analyzed using genomic sequencing.Based on this，the fungi in the samples from the reclamation area and the control area were isolated，purified and molecularly identified and the diversity of culturable fungi was analyzed.[Result]The soil available phosphorus，available potassium and pH in the K1 and F1 areas showed significant differences，while the alkaline hydrolysis nitrogen and organic matter showed nonsignificant differences;the species richness and uniformity in K1 area were lower than those in F1 area.19 fungal genera were identified in K1 area，and 52 fungal genera were identified in F1 area.The predictive function of fungi in K1 area was 11 less than that in F1 area.Penicillium sp.and Fusarium sp.were the main fungi isolated and identified in K1 area，while Penicillium sp.and Trichoderma sp.were the main fungi isolated and identified in F1 area.[Conclusion]The study provides theoretical basis and practical guidance for ecological restoration and soil improvement in mining areas.

Key words Reclaimed area of mining dump;Physical and chemical properties;Fungal diversity;Soil improvement

基金項目

國家重點研發計劃“重大自然災害監測預警與防范”重點專項（2017YFC1503100）;科技部基礎性工作專項重點項目（2013FY113400）。

作者簡介 劉寶勇（1975—），男，遼寧葫蘆島人，副教授，博士，從事水土保持與礦山環境工程方面的教學與科學研究;王麗莎（1992—），女，遼寧丹東人，碩士研究生，研究方向：生態修復理論與技術。劉寶勇和王麗莎是共同第一作者。*通信作者，講師，博士，從事真菌及真菌毒素控制技術研究。

收稿日期 2020-03-30;修回日期 2020-04-21

阜新露天礦是亞洲第一大露天煤礦，已因資源枯竭而關閉，但由于長期的開采造成生態環境破壞嚴重，礦區周邊排土場土壤重金屬含量升高，土壤養分流失，嚴重影響了排土場復墾區作物的生長[1-2]。對礦區排土場的生態重建工作一直是近年來國內眾多專家和學者所關注和研究的熱點之一。現代農業復墾是對排土場綜合治理的重要手段之一。目前我國大部分農業復墾以傳統土木工程復墾為主，但傳統復墾方式使地表的土壤經過了機械壓實，從而使土壤的孔隙度變小，團粒結構也受到了破壞，嚴重影響了植物根系在復墾地表土壤中的生長和延伸;利用生物復墾能高效恢復和提高土壤的質量和肥力、改善土壤團粒結構、促進土壤生物多樣性，從而實現礦區排土場生態修復與土地可持續利用[3]。目前，微生物復墾技術已成為國內外研究的前沿和熱點。微生物復墾技術與傳統復墾方式相比具有技術費用低、復墾效果好、不會造成二次污染、操作簡單等優點[4]。土壤真菌生物多樣性是影響土壤品質和作物生長的重要因素。Bacon等[5]研究發現，感染了木霉菌（Trichoderma sp.）的植物和玉米種子被人食用后，可以有效減輕體內的鐮刀菌毒素對人及其動物和牲畜的健康危害。曲霉屬（Aspergillus sp.）和鐮刀菌屬（Fusarium sp.）真菌是玉米整個生命周期中最主要的致病菌，單格孢屬（Ulocladium sp.）、鏈格孢屬（Alternaria sp.）、木霉屬（Trichoderma sp.）在我國玉米的生長初期較為多見[6]。枝頂孢屬真菌（Acremonium zeae）可以在土壤中產生多種抗生素，對玉米病原菌串珠鐮刀菌（Fusaraum verticillioides）和黃曲霉（Aspergillus flavus）的繁殖和生長起到抑制作用[7]。農業產中，有害植物真菌的大量積累會直接引起農作物產量的降低，有益植物真菌具有促進農作物植株生長、防治有害真菌及吸附土壤中重金屬的作用[8]。

因此，對阜新礦區排土場復墾區和普通種植區玉米根際土壤中真菌遺傳多樣性進行分析，探討相同的氣候和不同土壤條件下真菌遺傳多樣性的關系和差異，并對2個類型土壤中的真菌進行分離、純化和鑒定。研究結果有利于完善阜新礦區農業廢棄地復墾的方法，有助于降低采礦過程帶來的環境微生物污染和促進礦區土地微生物資源的合理利用，同時為同類型的礦區復墾區的土壤改良與治理提供參考，也為阜新礦區農業廢棄地土壤生態環境的恢復與治理的研究提供理論依據和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 研究區概況 阜新市海州露天礦排土場復墾區地處遼寧省西北部低山丘陵區（121°40′12″E，41°57′36″N），總面積約為 13 km2，排土場區域呈階梯狀，溝壑縱橫，陡坎坡平均坡度45°，盤面海拔平均為270 m，相對高差為3～60 m，最高處接近325 m，最低處不低于240 m，年均氣溫6.5～7.5 ℃，年均降水量420～540 mm，年均無霜期154 d，≥0 ℃活動積溫3 647 ℃·d，≥10 ℃活動積溫3 377 ℃·d。復墾區種植的玉米植株矮化，不結穗或畸形穗，幾乎顆粒無收。

阜新市太平區下洼子村距海州露天礦排土場復墾區5 km，與露天礦排土場復墾區氣候相同，玉米長勢良好，籽粒飽滿。

1.2 土壤樣品采集與分析

于2018年8月分別對阜新海州露天礦排土場復墾區（K1區）和太平區下洼子村對照區（F1區）的玉米種植地的土壤多點取樣。K1區和F1區分別設計5個采樣點，每個采樣點在10 m×10 m的范圍內按對角線法取5個子樣品（2 cm寬、5 cm深的土壤），混合為1個樣品，土壤樣本用冰盒保鮮帶回。帶回的樣品過 1 mm 篩，一部分置于-80 ℃ 冰箱保存備用，一部分放于4 ℃冰箱中保存以便近期試驗使用，其余樣品自然風干，用于土壤理化性狀分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤性質測定方法。K1區和F1區的土壤pH采用pH計法測定（LY/T 1239—1999）;堿解氮采用堿解擴散法測定;速效鉀采用酸溶法測定;K1區酸性土壤有效磷采用氟化銨-鹽酸浸提法測定，F1區的中性土壤有效磷采用碳酸氫鈉浸提法測定（LY/T 1228—2015）;有機質采用容量分析法測定（LY/T 1237—1999）。

1.3.2 土壤真菌DNA提取及高通量測序。

采用SDS方法對土壤樣本的基因組DNA進行提取并檢測純度和濃度，隨后對目標片段進行PCR擴增及PCR產物回收純化，之后使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建及熒光定量，由北京諾禾致源生物信息技術有限公司利用Illumina NovaSeq 測序平臺對該文庫進行雙末端測序（Paired_End）分析。PCR擴增所用的引物為ITS5-1737F：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和ITS2-2043R：5′-CAACTCTTAGCGGTGGAT-3′。

1.3.3 土壤真菌的分離、純化與分子鑒定。

采用稀釋平板法對土壤真菌進行培養，所用培養基為添加鏈霉素的PDA培養基，利用無菌接種環挑取菌落邊緣菌絲接種于新的平板中進行分離，培養3～5代，確保獲得純化菌株。

將純化菌株接種于PDA平板上，28 ℃避光培養5～7 d。挑取菌絲體置于無菌研缽，液氮研磨。參照真菌基因組DNA小量提取試劑盒步驟進行操作，得到提取出的DNA溶液，-20 ℃保存備用。PCR擴增引物為ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGC）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）;PCR擴增反應程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環，72 ℃最后延伸7 min。由青島派森諾生物科技有限公司利用 Illumina Mi Seq 測序平臺進行雙端測序分析。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2010對土壤理化指標進行數據處理和顯著性差異分析。

測序數據分析首先對原始數據（Raw reads）進行拼接、過濾，得到Clean Tags，Clean Tags經過嵌合體的去除得到有效數據（Effective Tags），然后利用Uparse軟件對有效數據進行聚類，默認以97%的一致性（identity）將序列聚類成為OTUs（operational taxonomic units），同時會選取OTUs的代表性序列，依據其算法原則，篩選OTUs中出現頻數最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA132的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析（設定閾值為0.8～1.0），獲得分類學信息并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成。使用MUSCLE軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統發生關系。

使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods_coverage、PD_whole_tree 指數，使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線、等級聚類曲線，并使用R軟件進行Alpha多樣性指數組間差異分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化分析

土壤的理化性質是影響微生物多樣性和作物生長的重要因素。因此，分別對復墾區（K1區）和對照區（F1區）的5個土壤樣品進行理化指標分析，結果見表1。從表1可以看出，K1區和F1區的堿解氮和有機質差異不顯著，F1區的有效磷顯著高于K1區，速效鉀遠低于K1區，且K1區土壤呈酸性，pH為5.75±0.14。研究認為，酸性土壤嚴重影響作物對土壤營養的吸收，其中堿解氮、速效鉀在pH為6～8時有效性最高，有效磷在土壤pH為5.5～7.5時有效性最大，玉米生長最適的土壤pH為6.0～7.5[9]。因此，復墾區土壤pH偏低可能是影響微生物多樣性和玉米生長狀況及產量的重要因素。

2.2 土壤真菌遺傳多樣性分析

2.2.1 土壤真菌α多樣性指數和物種多樣性曲線。

對樣本在97%一致性閾值下的α多樣性指數（Shannon、Simpson、Chao1、ACE、Goods_coverage、PD_whole_tree）進行統計，見表2。從表2可以看出，F1區土壤樣品中真菌群落的α多樣性指數Shannon、Simpson、Chao1、ACE和PD_whole_tree均顯著高于K1區。

從樣本中隨機抽取一定測序量的數據，統計它們所代表物種數目（即OTUs數目），以抽取的測序數據量與對應的物種數來構建稀釋曲線，見圖1。K1區樣本的真菌物種稀釋曲線OUT數量在100～200逐漸趨向平坦，F1區樣本的真菌物種稀釋曲線OUT數量在500以上逐漸趨向平坦，說明兩區測序樣本數量合理并且數量充足，測序數量逐漸趨于飽和，且F1區真菌物種數量比K1區更豐富。將樣本中OTUs的排序編號和OTUs中的相對豐度繪制成Rank Abundance曲線，見圖2。K1區樣本的真菌等級聚類曲線的跨度較小，總OTUs數量接近200;F1區樣本的真菌等級聚類曲線的跨度較大，總OTUs數量在500～600，說明F1區的物種豐富度和均勻度均高于K1區。

2.2.2 真菌群落共有及特有OTUs分析。

將稀有的、豐度值低于全體樣本總測序量1/100 000（0.001%）的OTU去除，在全部樣本中共檢測出OTU的數量為602個，把去除稀有OTU豐度的矩陣用于后續研究。根據聚類得到OTUs結果，分析不同樣本（組）之間共有、特有的OTUs，繪制成韋恩（Venn）圖（圖3）。K1區與F1區經研究分別檢測到185和554個OTU，其中共有OUT數為137個，K1區與F1區特有的OTU數分別為48和417個。

2.2.3 真菌物種門水平相對豐度分析。

根據物種注釋結果，選取每個樣本或分組在各分類水平（Phylum、Class、Order、Family、Genus）上最大豐度排名在前的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，以便直觀查看各樣本在不同分類水平上相對豐度較高的物種及其比例。以門水平物種相對豐度柱形圖為例展示如下（圖4），其中F1區除未知菌門（47.6%）外，依次為子囊菌門（Ascomycota）38.5%、被孢菌門（Mortierellomycota）6.8%、擔子菌門（Basidomycota）5.9%、球囊菌門（Glomeromycota）0.7%、壺菌門（Chytridiomycota）0.3%、被孢霉門（Mucoromycota）0.1%、捕蟲霉門（Zoopagomycota）0.1%;K1區以擔子菌門（Basidomycota）為主（72.2%），其次為未知菌門22.8%、子囊菌門（Ascomycota）4.1%、被孢菌門（Mortierellomycota）0.5%、壺菌門（Chytridiomycota）0.3%、捕蟲霉門（Zoopagomycota）0.1%。 K1區與F1區相比，缺少了球囊菌門和被孢霉門。

2.2.4 真菌物種屬水平豐富度分析。

為了進一步研究屬水平物種的系統進化關系，通過多序列比對得到top100屬的代表序列的系統發生關系（圖5）。其中，K1區鑒定出19個屬，除未知種屬24.2%外，主要為糞傘科（Bolbitiaceae）未知屬72.0%、煤炱目（Capnodiales）未知屬0.8%、毛球殼科（Lasiosphaeriaceae）Echria sp.屬0.7%、毛殼菌屬（Chaetomium sp.）0.5%、鐮刀菌屬（Fusarium sp.）0.4%、青霉屬（Penicillium sp.）0.4%、被孢霉科（Mortierellaceae）未知屬0.4%、赤霉屬（Gibberella sp.）0.3%、Rhizophlyctis sp.屬0.3%;而F1區共鑒定出52個屬，除未知菌屬61.8%外，主要為赤霉屬（Gibberella sp.）8.0%、綠僵菌屬（Metarhizium sp.）6.2%、鐮刀菌屬（Fusarium sp.）5.5%、青霉屬（Penicillium sp.）4.7%、被孢霉科（Mortierellaceae）未知屬3.9%、毛殼菌屬（Chaetomium sp.）3.1%、被孢霉屬（Mortierella sp.）2.8%、格孢菌目（Pleosporales）未知屬2.7%、Solicoccozyma屬1.3%。其中，煤炱目（Capnodiales）未知屬、毛球殼科（Lasiosphaeriaceae）Echria sp.屬為K1區特有菌屬，F1區除上述主要菌屬外，另外還包括屬于叢枝菌根的無梗囊霉屬（Acaulospora sp.）0.7%和木霉屬（Trichoderma sp.）真菌0.6%等益生菌。從以上結果可以看出，K1區和F1區群落在屬水平上差異顯著。

2.2.5 土壤真菌功能預測。

利用FunGuild真菌環境功能數據庫，基于擴增子分析得到的物種信息，分析K1區和F1區真菌物種在環境中的生態功能，見圖6。K1區依次主要為未定功能（97.6%）、未定義腐生物（1.1%）、糞腐-未定義腐生物-木腐生物（0.5%）、植物病原-土壤-木腐生物（0.4%）、植物病原（0.3%）、動物病原（0.1%）。F1區真菌依次主要為未定功能（64.1%）、未定義腐生物（11.7%）、植物病原（8.8%）、動物病原（6.4%）、植物-病原-土壤-木腐生物（5.4%）、糞腐-未定義腐生物-木腐生物（3.0%）、叢枝菌根（0.6%）。K1區真菌功能范圍與F1區相比，K1區比F1區少11種功能，其中更是缺少了具有重要生態學功能的叢枝菌根。

2.3 土壤真菌的分離純化和分子鑒定

2.3.1 土壤真菌的分離純化。

在對土壤真菌多樣性分析的基礎上，對土壤中的真菌進行分離和純化，進一步分析土壤中可培養菌種的多樣性。K1區分離純化出真菌菌株97株，F1區分離純化出真菌菌株124株。分離所得的部分不同形態的真菌如圖7所示。

2.3.2 DNA提取、測序。

對分離的土壤真菌進行DNA提取，部分土壤真菌rDNA ITS序列電泳圖見圖8。取各個菌種純化后的PCR產物進行DNA測序。用NCBI Blast程序將拼接后的序列文件與NCBI核酸數據庫中的數據進行比對，得到與待測物種序列相似性最大的物種信息。其中，K1區測序成功的菌種共78株，F1區測序成功的菌株98株，部分菌種序列比對結果如表3所示。

K1區測序成功菌株分屬6個種屬，分別為青霉屬（Penicillium sp.）真菌32株（42%），依次為草酸青霉（P.oxalicum）9株、微紫青霉（P.janthinellum）7株、波羅尼卡青霉（P.polonicum）5株、匍匐莖青霉（P.stoloniferum）4株、黃連青霉（P.chrysogenum）3株、拜萊青霉（P.bilaiae）2株、魯本斯青霉菌（P.rubens）1株、橘灰青霉（P.aurantiocandidum）1株;鐮刀菌屬（Fusarium sp.）真菌22株（28%），分別為三線鐮刀菌（F.tricinctum）5株、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）4株、串珠鐮刀菌（F.verticillioides/G.moniliformis）13株;鏈格孢霉（Alternaria sp.）鏈格孢菌（A.alternata）真菌8株（10%）;曲霉屬（Aspergillus sp.）菌核曲霉（A.sclerotioniger）真菌8株（10%）;毛霉菌屬（Mucor sp.）真菌4株（5%），分別為總狀毛霉（M.racemosus）2株、脆弱毛霉（M.fragilis）2株;木霉菌屬（Trichoderma sp.）真菌4株（5%），分別為棘孢木霉（T.asperellum）2株、擬康寧木霉（T.koningiopsis）1株、哈茨木霉（T.harzianum）1株。F1區測序成功的菌株分屬6個種屬，依次為青霉菌屬（Penicillium sp.）真菌56株（57%），分別為草酸青霉（P.oxalicum）34株、黃連青霉（P.chrysogenum）12株、臥青霉（P.decumbens）5株、二毒霉青霉（P.dipodomyicola）5株;哈茨木霉（T.harzianum）真菌28株（29%）;鐮刀菌屬（Fusarium sp.）藤倉鐮刀菌（F.fujikuroi）真菌5株（5%）;枝孢菌屬（Cladosporium sp.）真菌4株（4%），分別為C.Perangustum 2株、枝狀枝孢菌屬（C.cladosporioides）2株;曲霉屬（Aspergillus sp.）霉白曲霉屬（A.niveus）真菌2株（2%）;鏈格孢霉屬（Alternaria sp.）鏈格孢菌（A.alternata）真菌2株（2%）;毛孢子菌屬（Trichosporon sp.）阿薩希毛孢子菌屬（T.asahii）真菌1株（1%）。從測序結果來看，K1區和F1區分離的菌株在種類和數量上存在一定的差別。

3 討論

3.1 土壤理化性質對真菌多樣性的影響

土壤真菌群落是

有機物質分解和提高土壤生物質含量的主要來源和組成部分[10]，是土壤健康的重要生物學指標。同時，土壤中有機微

生物真菌群落的多樣性又受到了土壤有機質、pH、C、N、P及養分有效性等土壤環境因素的直接影響[11]。該研究中發現，雖然樣品采集地具有相同的自然氣候和土壤條件，但復墾區的土壤受阜新排土場的影響，其土壤速效鉀、有效磷、pH與對照區具有顯著的差別，使其真菌的組成、數量、群落生態結構和功能也與對照區相差較大。該研究中對土壤真菌多樣性的研究及對真菌的分離純化同樣發現，復墾區土壤中的有益菌種類和數量均遠低于對照區，而土壤中致病菌的數量和比例卻遠高于對照區。因此，研究認為復墾區土壤pH偏低等環境因素是造成土壤有益微生物真菌數量減少，有機質分解及N、P、K、S等多種營養元素的生態循環能力降低，植物有害真菌滋生的重要原因，從而造成了復墾區玉米植株矮化和不結穗。因此，阜新礦區復墾區的土壤改良和生態恢復初期，還是應該充分結合傳統改良和其他化學改良的方法，如適當增施農家肥、種植耐酸作物（主要如豆類、蕎麥等）以及適當增加噴施石灰調節土壤的耐酸性，從而有利于改善土壤的通透性，促進微生物的多樣性。

此外，重金屬的污染與土壤真菌的多樣性密切相關，土壤中的重金屬積累到一定程度，會嚴重影響微生物的種類和數量，進而影響土壤的呼吸作用[12]。但某些微生物在重金屬污染的土壤中能夠生長且對重金屬具有一定的解毒作用[13]。煤礦的開采，使得礦區及周邊地區土壤重金屬污染普遍較為嚴重[14-16]，該研究從K1區分離的真菌也驗證了這一點。K1區分離出的紫微青霉、草酸青霉、拜萊青霉以及鏈格孢霉等都是具有土壤重金屬吸附作用的典型土壤微生物[17-18]。

3.2 復墾區與對照區真菌多樣性差異

從復墾區與對照區土壤真菌α多樣性指數和土壤真菌物種均勻度多樣性指數的曲線可以看出，F1區的土壤真菌物種豐富度和均勻度均明顯高于K1區。從真菌物種門水平和屬水平相對豐度分析來看，在門水平上，F1區真菌門數比K1區多2個門。在屬水平上，F1區比K1區多32個屬，F1區屬的分布比例相對均勻，而K1區則嚴重不平衡。其中K1區優勢菌為糞傘科未知屬72.0%，除去未知種屬24.2%，其余種屬比例均小于1.0%。同時，K1區缺少了叢枝菌根的無梗囊霉屬和木霉屬等益生菌屬。從真菌的分離情況看，F1區真菌以青霉屬和木霉屬真菌為優勢菌，K1區以青霉屬和鐮刀菌屬真菌為優勢菌，大多數木霉菌和青霉菌為作物益生菌，而鐮刀菌是重要的致病菌。因此，K1區真菌種類少和比例的不平衡嚴重影響土壤性能和作物的生長，在利用真菌對土壤進行改良和生態修復時應關注增加真菌多樣性的方法和益生菌的利用。