節律基因CRY在腫瘤中的研究進展

杜勝奇,鐘江利,李福青，王 紅

生物鐘由視交叉上核在內的中央時鐘和肝臟、胰腺、肌肉、心臟和脂肪組織等外圍時鐘組成[1]。生物鐘代表古老的計時機制，通過眼睛對光線強度的感知，中央時鐘及外圍時鐘協同規范人類的作息、飲食和生殖等生理節奏，而生物鐘紊亂已被廣泛證明與腫瘤相關[2-4]。生物鐘的維持還需要節律基因的調節，CRY基因作為核心節律基因之一，在植物光解酶結構研究中首次被發現。雖然動物體內部分CRY蛋白已經失去了感光能力，卻是轉錄調控因子和細胞內信號級聯的參與者，這些級聯反應控制著晝夜節律、新陳代謝和DNA損傷反應等，CRY基因異常與腫瘤的發生、發展密切相關[5]。本文對節律基因CRY在腫瘤中的研究進展進行綜述如下。

1 節律基因概述

分子水平上，生物鐘的維持依賴于節律基因的轉錄翻譯正負反饋調節，目前發現的節律基因有CRY1、CRY2、PER1、PER2、PER3、CLOCK、BMAL1，NPAS2、CKIε、Tim、NR1D1、NR1D2、RORα、RORβ及RORγ等。由CLOCK、BMAL1正調控基因及CRYs、PERs負調控基因構成了最主要的反饋調節回路。 CLOCK/BMAL1二聚體正調控CRYs和PERs基因表達，于細胞質中形成CRYs/PERs蛋白復合物,積累到一定程度后進入細胞核，負調控CLOCK/BMAL1二聚體表達，隨后CRYs/PERs復合物降解解除了對CLOCK/BMAL1二聚體的抑制，促進了新的循環。這一循環周期為24 h，構成了人體最基本的晝夜節律[6]。CRYs基因參與的負反饋調節系統對維持晝夜節律是至關重要的，且比PERs基因具有更重要的地位[7]。

2 CRY基因抑癌作用

癌癥基因組圖譜數據庫分析發現CRY基因在多種惡性腫瘤組織中呈低表達[8]，表明CRY基因可能存在腫瘤抑制作用，但作用機制卻鮮有報道。FBXL3(F-box/leucine-rich repeat protein 3)是SCF (SKP1-CUL1-F-box-protein)E3泛素連接酶復合物的組成部分，CRY1或CRY2作為SCFFBXL3的輔助因子提供了潛在的底物資源，參與了多種蛋白的泛素化及降解，包括c-MYC蛋白、 TLK2(tousled-like kinase 2)蛋白等，CRY1基因缺陷和(或)CRY2表達減少提高了TLK2蛋白豐度，CRY2表達減少使c-MYC蛋白整體水平升高[9-10]。TLK2的擴增和過表達機械性的損害由CHK1/2參與的DNA損傷檢查點信號，導致G2/M檢查點缺陷，DNA修復過程延遲，染色體不穩定性升高[11]，而c-MYC是最常見的致癌基因之一，調控包括細胞生長周期、核糖體生物合成和代謝在內的生理過程，c-MYC蛋白表達增加與多種原發性癌癥相關[12]。可見，CRY基因在DNA損傷修復、細胞周期調控及組織代謝中起到重要作用，而CRY基因是否還存在其他抑癌機制需要更多的研究來發現。

3 CRY基因表達與腫瘤相關性

3.1CRY基因與結直腸癌 糖酵解對腫瘤細胞的增殖和侵襲至關重要，即使存在充足的氧氣，癌細胞也會表現出高水平的糖酵解。Guo等[13]提出在結直腸癌細胞系中miR-181d通過保護c-MYC蛋白免受FBXL3和CRY2介導的降解而促進有氧糖酵解，證實了CRY基因參與的c-MYC蛋白降解是重要的腫瘤保護機制。Mazzoccoli等[14]對50例結直腸癌組織及癌旁組織中CRY基因表達進行測定，熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)結果顯示，相比于癌旁正常組織，結直腸癌組織中CRY1和CRY2mRNA水平均顯著降低，提示CRYs低表達與結直腸癌發生相關。在臨床和病理特征上，腫瘤組織中較低的CRY1表達水平與年齡(62～74 歲)、女性以及腫瘤位置(橫結腸)存在顯著的相關性，同樣CRY2低表達與腫瘤位置(橫結腸)相關，根據其研究結果，推測結直腸癌在60～74歲人群及女性中好發，好發部位為橫結腸。與流行病學研究一致的是老年人中結直腸癌的發病率較高，但好發部位位于遠端結腸和直腸，且男性發病率高于女性[15]。因此，并不能單純使用CRY基因表達水平來預估結直腸癌發病風險，還需要更深入研究CRY基因在結直腸癌中的具體作用及機制。

3.2CRY基因與肝癌 肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma， HCC)和膽管細胞癌(cholangiocarcinoma, CCA)占原發性肝癌的絕大多數，是我國第2大癌癥相關死亡原因[16]。生物鐘紊亂可引起小鼠肝臟代謝整體性改變，不僅通過加速細胞質糖酵解促進脂肪的合成和儲存，而且增加氧化應激和支持細胞快速分裂的前體合成，從而促進肝纖維化和原發性肝癌進展[3]。近期研究發現CRY1在肝癌組織及癌旁組織中表達水平顯著低于正常肝組織，且其表達水平與腫瘤浸潤、淋巴結轉移相關[17]。Mteyrek等[18]實驗證實了CRY基因異常與肝癌相關，經二乙基亞硝胺(DEN)誘導5個月后，與野生型小鼠相比，CRY1-/-CRY2-/-小鼠出現了嚴重的肝發育不良，天冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶和堿性磷酸酶水平數倍升高；組織病理學檢查發現DEN暴露誘導的原發性肝癌數量(包括HCC及膽管癌)是野生型小鼠的近5倍，但HCC平均數量沒有顯著差異，CCA平均數量增加了近8倍，CRY1及CRY2基因低表達可能是原發性肝癌(尤其是CCA)的重要危險因素。另有研究納入489例接受根治性切除術的HCC，對13種節律基因的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms， SNPs)與臨床預后分析發現，攜帶CRY1rs3809236變異基因的患者相比野生純合子型，肝癌的總生存率降低且復發率增加[19]。CRY1rs3809236位于CRY1基因轉錄因子結合區，可能導致CRY1基因mRNA表達異常，結合上述研究表明，CRY1蛋白表達水平與肝癌發生、發展、預后相關，而是否存在CRY1rs380923可作為評估預后的標志物。

3.3CRY基因與胃癌 丁海濱和楊勇[20]對106份胃癌組織及癌旁組織標本研究發現，CRY1蛋白陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，且與浸潤深度、組織學分化程度以及TNM分期相關，且經隨訪發現CRY1陽性和陰性患者5年總生存率分別為58.33%(28/48)和79.31%(46/58)，表明CRY1陽性表達降低了胃癌預后。然而，癌癥基因組圖譜數據庫分析卻顯示CRY2基因在胃癌組織中低表達，涉及CRY2基因在胃癌中功能研究卻罕有報道[8]。有研究表示DNA損傷后，CRY1和CRY2具有不同的功能，CRY1-/-細胞對基因毒性應激的轉錄反應增強，而CRY2-/-細胞則減弱[21]，也許可以解釋CRY1、CRY2在胃癌組織中表達差異形成原因。

3.4CRY基因與胰腺癌 Relles等[22]采用實時熒光定量聚合酶鏈反應測定胰腺導管腺癌腫瘤組織(n=65)、鄰近正常胰腺組織(n=34)及胰腺良性病變組織(n=16)中CRY1和CRY2mRNA表達水平，并按中位數分為高低表達組分析其預后相關性，發現CRY2低表達組中位存活時間明顯縮短，且2年生存率約為高表達組的一半(22.3% vs 43.9%，P=0.0270)。由此可見，CRY2基因表達下調與胰腺癌生存預后相關，可作為預測胰腺癌生存結局的標志。而與正常胰腺組織及胰腺良性組織(包括胰腺腺瘤、囊腺瘤、上皮性囊腫或導管內乳頭狀黏液腫瘤)相比，腫瘤組織中CRY2基因表達降低，因此CRY2基因還可能作為胰腺腫瘤標志物區分良惡性病變，但需要更大樣本的研究來證明其臨床意義。

3.5CRY基因與乳腺癌 乳腺癌位居我國女性惡性腫瘤發病率首位，且呈緩慢上升趨勢，明確其發病機制對其防治有重要意義[16,23]。倒班工作造成的晝夜節律紊亂已被國際癌癥研究機構分級為可能的人類致癌物2A組，大量流行病學研究表明夜班工作會增加乳腺癌的發病率和病死率，基因特異性和全基因組分析顯示，長期倒班工作導致多個節律基因啟動子甲基化以及癌癥相關基因的類似變化[4]。Mao等[24]發現與健康對照組相比，乳腺癌患者CRY2啟動子甲基化程度更高。他們同時探索了CRY2與乳腺癌患者臨床參數的相關性及其在DNA甲基化等表觀遺傳過程中的參與。通過對Oncomine數據庫分析發現，與相鄰的正常組織或健康對照組的乳腺組織相比，乳腺癌組織中CRY2表達下調；而且CRY2低表達與雌激素受體陰性、腫瘤高分化及較短總生存時間相關。全基因組甲基化分析顯示共有1245個CpG位點隨著CRY2基因敲除而改變，包括細胞增殖(BAG1、CHKA)、凋亡(BCL2、BCL3)、黏附(CD44、CADM1)、侵襲和遷移(GPR54、GCNT2和USP4)以及激素調節(NR3C1、MTNR1A和PRLP)等基因。因此，CRY2基因表達減少在乳腺癌中導致了廣泛地與癌癥相關的表觀遺傳失控，CRY2基因可能作為乳腺癌易感性、進展和預后的生物標志物。

3.6CRY基因與骨肉瘤 骨肉瘤作為青少年常見惡性腫瘤，化學治療及手術治療效果欠佳[25]。為探究節律基因異常對骨肉瘤發生、發展影響，Yu等[26]發現CRY2基因敲除促進了人骨肉瘤細胞的增殖和遷移，進一步研究發現CRY2敲除后基質金屬蛋白酶2和β-catenin蛋白表達增加，基質金屬蛋白酶2通過破壞細胞外基質成分促進腫瘤侵襲，而β-catenin的異常激活與多種腫瘤發展密切相關。基于上述研究，初步認為CRY2基因在骨肉瘤具有腫瘤抑制作用。同時發現CRY2敲除降低了p53的表達，增加了c-Myc和cyclinD1蛋白表達，并通過細胞周期分析發現S期細胞數量增加，G1期細胞數量減少，再次證實了CRY基因調控細胞周期參與了骨肉瘤的演變[26]。進一步研究發現CRY1施加其腫瘤抑制活性是通過活化Akt/p53/p21信號通路，發揮Cdk2的抑制作用，控制細胞G1/S期過渡[27]。上述研究表明了CRY基因與骨肉瘤發生、發展有密切聯系，可能作為治療骨肉瘤的目標靶點。

3.7CRY基因與其他腫瘤 除上述腫瘤外，關于CRY基因的研究還涉及其他腫瘤，包括子宮內膜癌、頭頸部鱗癌、皮膚癌、神經膠質瘤、胸膜間皮瘤、慢性淋巴細胞白血病、慢性粒細胞白血病[28]、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌[29]及醛固酮腺瘤[30]等。CRY基因作為腫瘤抑制基因，在不同腫瘤中具體作用機制尚不清楚，但現有研究表明其在DNA損傷修復、細胞周期調控、組織代謝及慢性炎癥等方面均起到重要作用，有待進一步的研究來佐證[3,5,31-32]。

4 CRY基因與腫瘤化學治療

4.1CRY基因與結直腸癌化學治療 隨機選擇16例Ⅲ期原發性結直腸癌接受新輔助化學治療前腫瘤組織標本，分為完全緩解和部分緩解組，腫瘤穩定和腫瘤進展組各8例，發現腫瘤穩定和腫瘤進展組具有更高的CRY2表達，表明CRY2高表達可能對新輔助化學治療存在不利影響[33]。Fang等[33]對289例結直腸癌Kaplan Meier生存曲線分析發現CRY2高表達與較低的生存率相關，在接受輔助化學治療的患者中其相關性更明顯。為了進一步研究CRY對結直腸癌化學治療的影響，使用特異性siRNA下調CRY2在DLD-1、SW480 細胞系中表達，結果加速了奧沙利鉑誘導的細胞凋亡，表明CRY2低表達增加了結直腸癌細胞對化學治療的敏感性。研究發現FBXW7(F-box and WD repeat domain-containing 7)過表達提高了結直腸癌細胞株對奧沙利鉑的敏感性，而CRY2以劑量依賴性方式隨著FBXW7增加而降低,FBXW7通過提高CRY2泛素化水平負向調控CRY2的穩定性，因此FBXW7-CRY2軸在化學治療敏感性中至關重要，同時在289例人結直腸癌腫瘤組織中觀察到FBXW7-CRY2軸的失調[33]。以上證實CRY2表達水平可能用于預測結直腸癌患者對化學治療的敏感性，而對CRY2蛋白抑制將是一種有效的治療方法用于克服腫瘤耐藥性的形成

4.2CRY基因與胃癌化學治療 Qu等[34]使用COX回歸模型，對1030例胃腺癌根治性切除術總生存率和5種節律基因(CRY1-2、PER1-3)中13個SNPs進行相關性分析，其中包括CRY1rs1056560在內的3個SNPs被證明與胃癌總生存率高度相關，并且在CRY1rs1056560等位基因突變型(TG/GG)胃癌患者中，鉑類輔助化學治療對患者生存預后具有更顯著保護作用，表明CRY1rs1056560可能作為胃癌對鉑類藥物敏感性的預測性標志物。SNPs在調控基因表達、mRNA降解和翻譯及影響蛋白質生物學功能的蛋白質結構中發揮著重要作用，相比于野生純合子基因型(TT)患者，基因突變型(TG/GG)CRY1基因mRNA 表達水平明顯下調，表明rs1056560這一可遺傳的變異降低了CRY1合成，結合上述研究，證實胃癌化學治療預后與CRY1基因低表達呈正相關。

5 小結

由于消化和內分泌功能具有明顯節律性與我們進食、作息相關，如上述，晝夜節律紊亂更多地增加了相關癌癥易感性[29,35]。可以看到，節律基因CRY作為腫瘤抑制基因，參與了細胞周期、DNA損傷及組織代謝過程，其異常表達與癌癥的發生和發展相關，同時也影響了化學治療的敏感性和預后。未來臨床對于CRY基因的檢測，可能作為預測相關腫瘤風險以及化學治療敏感性的重要指標；如能進一步人為調控CRY基因在腫瘤組織中表達，抑制腫瘤發展，將為腫瘤的治療提供新方向。