菌球形態與檸檬酸產量相關性研究

劉會 鄭文瑤 孫小雯 鄭之明

摘要 ? ?黑曲霉作為一種絲狀真菌，其發酵過程中的菌絲形態對檸檬酸產量影響巨大。本文通過調控接種孢子濃度和搖床轉速，對黑曲霉菌球形態和檸檬酸產量的相關性進行了研究。結果表明，菌球直徑和致密度是至關重要的形態參數，將其控制在合適范圍可顯著提高檸檬酸產量。本研究為檸檬酸工業生產中黑曲霉菌株的代謝改造和過程調控提供了參考。

關鍵詞 ? ?檸檬酸;黑曲霉;菌球形態;接種量;產量;相關性

中圖分類號 ? ?TQ921+.1 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）20-0201-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

檸檬酸作為全世界需求量最大的有機酸之一，廣泛用于食品、化工、醫藥等行業[1]。黑曲霉是檸檬酸工業生產的主要菌種。作為一種絲狀真菌，其發酵過程中的菌絲形態可呈現出離散菌絲、菌絲團和菌球3種截然不同的狀態。大量研究表明，菌絲體形態是改變發酵液流變學性質并最終影響代謝產物合成的核心因素，對細胞代謝、發酵過程、產物積累及后續的分離提取均有顯著影響[2-3]。因此，本文通過調控檸檬酸發酵中的初始接種孢子濃度和搖床轉速，開展了黑曲霉菌球形態與檸檬酸發酵的相關性研究，以期為實際生產提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

1.1.1 ? ?供試菌株。黑曲霉chsC-3，由中國科學院強磁場與離子束物理生物學重點實驗室保存。

1.1.2 ? ?產孢培養基。采用馬鈴薯（PDA）培養基。取300 g馬鈴薯去皮，稱取200 g切成小塊或削成片后放入鍋中，加入1 000 mL水，煮沸后維持20～30 min。趁熱用2層紗布過濾，棄濾渣。取濾液補水至1 000 mL，加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂，加熱溶化，趁熱分裝，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.3 ? ?發酵培養基。采用玉米液化清液[4]。取200 g過60目篩的玉米粉，加入1 000 mL水，攪拌加熱至60 ℃加入耐高溫α-淀粉酶，90 ℃保溫液化2 h，碘試呈棕色后液化結束。經110目濾布過濾后加入葡萄糖，使總糖濃度約17%。分裝后，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 ? ?試驗方法

將實驗室保存的黑曲霉chsC-3菌株接種在含產孢培養基的試管斜面上，在36.5 ℃條件下培養7 d。刮取一定量的孢子置于含玻璃珠的無菌水中，旋轉振蕩將孢子打散，3層紗布過濾，制備成孢子懸液，用血球計數板計數。分別以5×103、5×104、5×105、5×106、5×107、5×108個/mL的濃度接種到含有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，搖床轉速選取150、180、210、240、270、300 r/min 6個條件，36.5 ℃條件下培養3 d。

1.3 ? ?測定指標

使用Olympus TH4-200顯微成像系統獲取菌絲圖像（放大100倍）。利用ImageJ軟件對菌絲顯微圖像進行處理和分析，獲得菌球直徑、菌球核心面積和菌球投影面積等形態學參數。菌球致密度由核心面積除以投影面積的比值決定。總酸含量通過斐林試劑法進行檢測。

2 ? ?結果與分析

2.1 ? ?接種量對菌球形態的影響

孢子接種量對發酵過程中的黑曲霉菌體形態影響顯著。當接種量高于5×107個/mL時，黑曲霉菌體形態以離散菌絲或者纏繞的菌絲團為主，無法正常結球，致密度較低，發酵液黏度較大;當接種量為5×103～5×106個/mL時，黑曲霉發酵過程中的菌體均以菌球形態存在，且菌球直徑與孢子濃度成負相關。當接種量為5×103個/mL時，菌球直徑較大，致密度很高且菌球數目相對較少，究其原因可能是孢子碰撞形成晶核的概率受到孢子濃度的影響，接種量越小，孢子碰撞的概率也就越小，形成的晶核較少，菌球數目較少。當增大到5×104個/mL時，菌球直徑變小，小于100 nm，形成晶核的概率增大，晶核數目明顯增多，形成的菌球數目也明顯增加。當接種量為5×105～5×106個/mL時，菌球直徑進一步減小，致密度有所增加。

2.2 ? ?接種量對檸檬酸產量的影響

孢子接種量對檸檬酸產量的影響非常大。當接種量為5×103～5×108個/mL時，檸檬酸產量呈現先上升后下降的趨勢。當接種量低于5×104個/mL時檸檬酸產量逐漸上升，進一步提高接種量，產酸降低;當接種量達到5×107個/mL時，產酸劇烈下降;當接種量繼續增高至5×108個/mL時，產酸可忽略不計。

2.3 ? ?不同接種量下菌球形態與檸檬酸產量的相關性

從以上結果可以看出，孢子接種量對發酵過程中黑曲霉菌絲形態和最終的檸檬酸產量的影響巨大。以此為基礎，進一步對菌球形態和檸檬酸產量的相關性進行分析。當接種量為5×103個/mL時，形成的黑曲霉菌球直徑過大且非常致密，菌球內部細胞會受到擠壓而導致分子擴散不能自由進行，菌球的中心區域會發生細胞自溶而變成空心，影響檸檬酸合成;當接種量增大到5×104個/mL時，菌球直徑小于100 nm，且致密度適中，利于菌球內部及菌球和外部環境間氧氣和營養物質的傳輸，是最利于產生檸檬酸的形態;當接種量繼續增大時，雖然菌球直徑仍然較小，但致密度有所增長，影響菌球內部的氧氣和營養傳輸，產酸有所下降;當接種量高于5×107個/mL時，以離散菌絲或者菌絲團為主，發酵液黏度過大嚴重阻礙氧氣和營養物質的傳遞，抑制檸檬酸合成。

2.4 ? ?不同搖床轉速對菌球形態和檸檬酸產量的影響

黑曲霉發酵生產檸檬酸的過程是非常耗氧的，轉速的變化不僅能夠影響發酵液的溶氧，還會影響發酵液的混合效果及傳能傳質，另外還會對發酵過程中菌球的形成及形態產生影響。本研究選取150、180、210、240、270、300 r/min 6個搖床轉速條件，通過研究不同轉速對菌球形態和檸檬酸產量的影響，發現檸檬酸產量隨著搖床轉速的提高而不斷增加，試驗允許可設置的最高轉速（300 r/min）最利于檸檬酸的積累，而且轉速越高，形成的菌球數目增多，菌球直徑變小，致密度增大。高轉速不僅可以滿足檸檬酸發酵過程對溶氧的需求，促進菌體生長，而且轉速提高未對菌球造成可見的機械損傷，菌絲碎片少，菌球完整且較光滑。究其原因可能是高轉速產生了大剪切力，切除了菌球邊緣突出菌絲，限制了菌球的增大并使菌球纏繞致密[5]，進而利于菌球內部及菌球與發酵液之間的傳質傳氧，促進檸檬酸積累。在工業生產中發酵罐轉速范圍廣，可以達到較高轉速。因此，可以綜合考慮成本等因素，通過將發酵罐的轉速提高到合理范圍來獲得有利的菌球形態，從而促進檸檬酸合成。

3 ? ?結論與討論

目前，我國檸檬酸年產量約200萬t，占全世界總產量的60%以上，是世界第一的檸檬酸生產和出口國。近年來，隨著檸檬酸在新型產業領域如金屬清潔劑與無毒增塑劑等領域的開發應用，其全球市場需求量逐年增長（平均每年遞增5%），從而導致提高檸檬酸生產效率成為一種迫切需求。檸檬酸的工業生產菌——黑曲霉作為一種典型的絲狀真菌，影響其生產效率的因素有很多，菌絲體形態是其中最有效的參數之一，對發酵液的流變學性質及發酵過程中的氧氣和營養物質的傳輸有重大影響。本研究對黑曲霉菌球形態和檸檬酸產量之間的相關性進行了探討，發現在黑曲霉發酵生產檸檬酸的過程中，菌絲體形態對檸檬酸產率有非常重要的影響，其中菌球直徑和致密度是至關重要的形態參數，將其控制在合適范圍內可顯著提高檸檬酸產量。當菌絲體離散生長時，發酵液黏度增加，限制了營養物質和氧氣在發酵液中的傳遞，不利于菌體生長和檸檬酸的積累;如果形成的菌球直徑較大且致密度過高，菌球內部不易與外部培養液交換營養和氧氣，同樣會降低檸檬酸產率。綜上所述，本研究為檸檬酸工業生產中黑曲霉菌株的代謝改造[6]和過程調控提供了參考。

4 ? ?參考文獻

[1] 王博彥，金其榮.發酵有機酸生產與應用手冊[M].北京：中國輕工業出版社，2000.

[2] YANG J，JIAO R H，YAO L，et al.Control of fungal morphol-ogy for improved production of a novel antimicrobial alkaloid by marine-derived fungus Curvularia sp.IFB-Z10 under submerged fermentation[J].Process Biochem，2016，51（2）：185-194.

[3] WUCHERPFENNIG T，KIEP K A，DRIOUCH H，et al.Morp-hology and rheology in filamentous cultivations[J].Adv Appl Microbiol，2010，72：89-136.

[4] 孫小雯，鄭之明，駱家玉，等.黑曲霉幾丁質合成酶基因chs形態突變株的構建[J].食品工業科技，2016，18（37）：218-223.

[5] GIBBS P A，SEVIOUR R J，SCHMID.Growth of filamentous fungi in submerged culture：problems and possible solutions[J].Crit Rev Biotechnol，2000，20（1）：17-48.

[6] 楊曉濤，郭艷梅，曾祥峰，等.黑曲霉產檸檬酸的發酵過程表征及乙醛酸的形成[J].現代食品科技，2011，27（10）：1183-1186.