烤煙陳化與葉面微生物研究綜述

陳強 姜振玲 王玉華 古明光 王德權 席元肖 杜傳印

摘要 ? ?烤后煙葉表面存在大量微生物，研究表明，微生物對煙葉品質的提升有著重要影響。本文分析了煙葉陳化期間品質變化及機理，綜述了煙葉表面微生物種類及動態(tài)變化，并就微生物在改良煙葉品質方面的應用展開討論，以期為煙草行業(yè)提質增效、降焦減害提供參考。

關鍵詞 ? ?烤煙;微生物;種類;應用

中圖分類號 ? ?TS41+4 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）20-0203-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

煙草是世界上廣泛種植的經濟作物，其主要收獲器官為葉片。煙草產業(yè)在國民經濟中占有重要的地位。為提升煙葉品質，提高烤后煙葉的工業(yè)可用性，并進一步提升中國煙草在國際市場上的競爭力，需要進一步重視提高煙草及其制品的質量。研究發(fā)現(xiàn)，煙葉品質不僅與品種、生態(tài)[1-2]、管理措施及烘烤工藝等前期各項因素存在相關性，同時與烤后煙葉儲存條件存在顯著的相關性，這其中包括微生物活動。

1 ? ?煙葉陳化期間品質變化及機理

1.1 ? ?煙葉陳化對品質的影響

鮮煙葉經歷烘烤與打葉復烤過程后，煙葉質量雖有一定的改善與提高[3]，但仍然存在青雜氣過重、刺激性高、香氣質單調和香氣量不足[4]等缺陷，并不能完全滿足卷煙工業(yè)的需求，只有經歷陳化過程才能使煙葉品質得到進一步提升，滿足工業(yè)可用性需求。陳化期間煙葉主要變化表現(xiàn)為：色度變強并且色澤趨向均勻一致，葉片韌性、彈性增加，其物理性狀更加利于制絲加工;還原糖、總糖、致香物質及氨基酸等各項化學成分含量逐漸趨于協(xié)調。

在煙葉感官評吸質量方面，經陳化后的煙葉香氣質、香氣量、余味、雜氣、刺激性等感官評吸指標均顯著提升[5]。

1.2 ? ?煙葉陳化機理

針對上述變化，前人對煙葉陳化機理進行了較多的研究，對其作用機理的解釋主要集中在酶作用、微生物作用和化學作用3個方面[6]。Koller等最早研究煙葉陳化機理，他們認為雪茄煙葉的陳化是微生物作用的結果。目前，學術界普遍認為，煙葉表面微生物在陳化過程中起著極其重要的作用，其作用貫穿煙葉品質變化的整個過程。一方面，通過自身生命活動作用于煙葉陳化;另一方面，其代謝活動產生的酶能夠有效催化煙葉中物質轉化。具體來講，煙葉表面微生物在自身代謝過程中可將煙葉中的淀粉、蛋白質、脂肪、氨基酸等大分子物質轉化為小分子物質，促進煙葉品質的提升[7-9]。

2 ? ?煙葉表面微生物種類及動態(tài)變化

2.1 ? ?種類

研究表明，煙葉表面微生物種類多、數(shù)量大。目前對煙葉微生物的鑒定方法有傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法[10]和DGGE技術[11]、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）技術及16S rDNA克隆文庫測序技術[12-13]等。孫玉宇[14]、高文霞等[15]研究發(fā)現(xiàn)，1 g葉片中微生物數(shù)量為5萬～8萬個，按照類別可分為細菌、霉菌、放線菌和酵母菌四大類。王 ?芳等[16]研究了陳化煙葉表面高溫微生物，結果表明，高溫微生物總量為103～105個/g，其中細菌占絕對優(yōu)勢，真菌較少，放線菌和酵母菌未檢出。徐潔[17]研究了烤后煙葉微生物數(shù)量和種類，發(fā)現(xiàn)煙葉表面微生物主要包括細菌、真菌和放線菌;細菌為優(yōu)勢菌屬，比例占90%以上，放線菌占比很小。趙銘欽等[18]對烤煙表現(xiàn)微生物進行研究，發(fā)現(xiàn)在煙葉品質改善過程中，細菌中的芽孢桿菌屬、放線菌中的鏈霉菌為優(yōu)勢菌屬，酵母菌為痕量。韓錦峰等[19]研究發(fā)現(xiàn)，煙葉中的微生物優(yōu)勢類群主要包括細菌、放線菌和霉菌三大類。邱立友等[20]對陳化過程中煙葉表面微生物進行檢測，結果表明，在發(fā)酵過程中細菌中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，而放線菌和霉菌數(shù)量較少。楊金奎等[21]從醇化煙葉表面僅分離出了細菌和霉菌，同樣芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。

2.2 ? ?動態(tài)變化

較多研究已證明，煙葉表面微生物種群數(shù)量及優(yōu)勢菌屬是動態(tài)變化的。一般來說，在煙葉陳化初期，微生物類群較多，原因可能在于初期煙葉表面有機物質含量較高，微生物可以充分利用，但隨著時間推移，有機物質及水分含量降低，絕大多數(shù)微生物數(shù)量大量減少。在優(yōu)勢菌屬方面，隨著煙葉陳化的進行，煙葉表面微環(huán)境發(fā)生著變化，從而影響到其表面優(yōu)勢菌屬的存在。Di Giacomo等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在陳化初期葡萄球菌科和乳酸桿菌目細菌為優(yōu)勢菌屬，在陳化后期芽孢桿菌屬成為優(yōu)勢菌屬。究其原因在于隨著陳化時間的增加，煙葉表面溫度和pH值逐漸升高，此種微環(huán)境更加適宜芽孢桿菌屬微生物生長繁殖。趙銘欽等研究表明，隨著陳化時間的延長，芽孢桿菌在微生物種類中所占的比例不斷提高，這也佐證了Di Giacomo等的論點。朱大恒等進行了細化研究，發(fā)現(xiàn)在陳化過程中細菌總數(shù)呈逐漸降低的趨勢。陳福星等[23]發(fā)現(xiàn)，在煙葉陳化后期，數(shù)量最多的是細菌，其次是放線菌和真菌。

綜上所述，前人研究結論存在一定的差異性，主要表現(xiàn)為兩方面。一是煙葉中微生物種類存在差異;二是優(yōu)勢菌屬存在差異。如同一部位不同產地煙葉在群落結構方面存在差異的同時，優(yōu)勢菌屬占比也存在不同，分析原因可能是煙草品種及陳化環(huán)境條件存在差異[24-25]。

3 ? ?微生物在改良煙葉品質方面的應用

3.1 ? ?微生物與煙葉感官評吸

現(xiàn)有研究已證明，煙葉在陳化過程中品質的提升與葉面微生物代謝存在直接或間接的關系。微生物通過一系列代謝活動，將煙葉中大分子物質逐漸轉化分解成小分子前體物質，對于煙葉品質的提升有一定的促進作用[26]。其中，芽孢桿菌屬細菌能降低煙葉中蛋白質含量[27]，從而減輕煙葉燃吸過程中的燒焦羽毛的氣味，其作用機理是將大分子蛋白質降解為小分子氨基酸，氨基酸在煙葉燃燒過程中可以參與美拉德反應產生香氣物質，有利提升煙葉香氣。李 ?寧等[28]利用蠟樣芽孢桿菌處理雪茄煙，煙葉的蛋白質較對照組降低13.53%。馮志珍等[29]利用芽孢桿菌（F-Y-11菌株）發(fā)酵煙絲，可使蛋白質降解29.32%。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，使用菌劑處理煙葉可以定向改善煙葉中其他化學成分的含量，使各化學指標更趨協(xié)調[30]。

目前，微生物在改善煙葉品質方面的應用研究主要思路為：先從煙葉或其他寄主表面分離微生物，經培養(yǎng)篩選后直接或配方施用，用以縮短煙葉陳化用時、改善煙葉評吸品質[31]。黃靜文等[32]利用短小芽孢桿菌Van35開展試驗，處理后的煙葉刺激性、雜氣及香氣質指標明顯改善。瞿嬌嬌等[33]利用從豆豉中分離的芽孢桿菌處理煙葉，煙葉香氣趨于醇和豐滿，煙氣更加細膩，雜氣、刺激性明顯減輕。此外，研究發(fā)現(xiàn)，泛菌屬微生物可降解煙葉中類胡蘿卜素物質，增加類胡蘿卜素降解產物含量，該物質為煙葉重要的致香物質，有助于提升煙葉的燃吸品質;部分放線菌可催化阿魏酸生成香蘭;將枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌按一定比例混合使用，可明顯提升煙葉吸食質量;利用產香微生物作為發(fā)酵菌株，制備煙草提質劑，能有效提升煙葉評吸質量;對于煙堿含量較高的煙葉，可以利用特定菌株發(fā)酵達到降堿的目的。

3.2 ? ?微生物與煙葉安全性

煙葉安全性問題始終是煙葉質量研究的重點。目前，微生物在降焦減害方面的研究極為普遍。研究發(fā)現(xiàn)，某些特定微生物可以有效減少煙葉燃吸時焦油產生量[34]。TSNA是一種煙草特有的有害物質，研究發(fā)現(xiàn)利用微生物可以在不同程度上減少煙葉和煙氣中TSNA含量，有效提高煙草制品安全性。其機理在于利用高效反硝化細菌將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，并進一步還原為氣體，從而降低TSNA含量[35]。孫政[36]利用惡臭假單胞菌發(fā)酵液處理烤煙葉片，在溫度28 ℃、相對濕度45%的條件下，陳化14 d時硝酸鹽降解達到2.25%，陳化21 d時亞硝酸鹽降解率達到19.90%。單宏英等[37]從玉溪煙葉中提取一種熒光假單胞菌（菌株AS97），將其制成發(fā)酵液后以5%接種量噴施，在溫度30 ℃、相對濕度60%的條件下，陳化10 d后檢測硝酸鹽、亞硝酸鹽、TSNA等物質的轉化率，分別達到68.77%、45.57%、45.47%。因此，在煙葉安全性方面，微生物將有較大的研究與應用空間。

4 ? ?展望

微生物是自然界中一個極其龐大的群體，與人類活動息息相關。目前，微生物在農業(yè)、食品工業(yè)、醫(yī)藥化工及生物能源應用等諸多領域已發(fā)揮出重要的作用。在煙草行業(yè)，雖有較多的研究，但多數(shù)成果仍停留在研究層面。針對目前行業(yè)較為關注的吸煙與健康問題，如何定向篩選出高效、安全的微生物菌株，以實現(xiàn)降焦（TSNA）減害，成為一個重要的研究方向。

5 ? ?參考文獻

[1] 韓錦峰，劉維群，楊素勤，等.海拔高度對烤煙香氣物質的影響[J].中國煙草，1993（3）：1-3.

[2] 劉國順，王可，劉靜靜，等.不同產地烤煙中性致香物質對比分析[J].江西農業(yè)大學學報，2010，32（1）：31-34.

[3] 李曉，姚光明，穆林，等.煙葉復烤前后香味成分的變化[J].河南農業(yè)科學，2010（1）：40-43.

[4] 王潔，曾代龍，符雷，等.晾曬煙葉發(fā)酵研究進展[J].河南農業(yè)科學，2014，43（4）：1-4.

[5] AJANDOUZ E H，PUIGSERVER A.Nonenzymatic browning reaction essential amino acids：effect of pH on caramelization and Maillard reaction kinetics[J].Agric Food Chem，1999（47）：1786-1793.

[6] 朱大恒，陳銳，陳再根，等.烤煙自然醇化與人工發(fā)酵過程中微生物變化及其與酶活性關系的研究[J].中國煙草學報，2001，7（2）：26-30.

[7] 唐麗，周冰，華一崑，等.醇化技術在改善煙葉品質中的研究進展[J].江西農業(yè)學報，2013，25（7）：53-56.

[8] 趙銘欽，李曉強.煙葉微生物發(fā)酵機理及生物制劑應用研究進展[J].甘肅農業(yè)大學學報，2007，42（6）：84-91.

[9] 金曉艷.復合生物添加劑對煙草陳化過程中有機酸和游離氨基酸含量影響分析研究[D].合肥：中國科學技術大學，2006.

[10] 何家亨，賀妮莎，胡君儒，等.陳化煙葉表面可培養(yǎng)寡營養(yǎng)菌多樣性分析[J].湖北農業(yè)科學，2013，52（6）：1292-1297.

[11] 伍雪瑩，梁書利，韓雙艷，等.不同陳化期烤煙葉表細菌的多樣性及發(fā)育分析[J].廣東農業(yè)科學，2014（18）：28-38.

[12] ZHAO M Q，WANG B X，LI F X，et al，Analysis of acterial communities on aging flue-cured tobacco leaves by 16S rDNA PCR-DGGE technology[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2007，73（6）：1435-1440.

[13] SU C，GU W，ZHE W，et al.Diversity and phylogeny of bacteria on Zimbabwe tobaccoleaves estimated by 16S rRNA sequence analysis[J].Applied Microbiology and Biotechno-logy，2011，92（5）：1033-1044.

[14] 孫玉宇.煙草發(fā)酵中微生物研究進展[J].現(xiàn)代農業(yè)科技，2014（9）：302-303.

[15] 高文霞，程祖鋅，王峰吉.烤煙發(fā)酵有益細菌的分離篩選及優(yōu)良菌株的鑒定[J].基因組學與應用生物學，2011（5）：104-109.

[16] 王芳，賴泳紅，米靜，等.不同陳化煙葉葉面高溫微生物多樣性[J].應用與環(huán)境生物學報，2012，18（3）：471-476.

[17] 徐潔.兩個真菌菌株對烤煙誘香機理的初步研究[D].泰安：山東農業(yè)大學，2006.

[18] 趙銘欽，邱立友，張維群，等.陳化期間烤煙葉片中生物活性變化的研究[J].華中農業(yè)大學學報，2000，19（6）：537-542.

[19] 韓錦峰，朱大恒，劉衛(wèi)群，等.陳化發(fā)酵期間烤煙葉面微生物活性及其應用研究[J].中國煙草科學，1997（4）：13-14.

[20] 邱立友，趙銘欽，岳雪梅，等.烤煙發(fā)酵高效菌株的篩選[J].河南農業(yè)大學學報，2000，34（3）：232-235.

[21] 楊金奎，段焰青，陳春梅，等.醇化煙葉表面可培養(yǎng)微生物的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析[J].煙草科技，2008（11）：51-55.

[22] DI GIACOMO M，PAOLINO M，SILVESTRO D，et al.Microbial community structure and dynamics of dark fire-cured tobacco fermentation[J].Applied and Environmental Microbiology，2007，73（3）：825-837.

[23] 陳福星，王磊，莫湘濤，等.煙葉微生物發(fā)酵的探討[J].湖南微生物學通訊，1990（2）：37-39.

[24] 周家喜.不同倉儲環(huán)境微生物群落對煙葉陳化品質的影響[D].貴陽：貴州大學，2017.

[25] 雷麗萍，BUSH L，COOEM S，等.煙葉生長和晾制期間細菌種群動態(tài)變化：煙草微生物細菌調控技術研究之一[J].中國煙草科學，2001（3）：4-6.

[26] 劉道全.生物制劑在烤煙自然醇化中的應用研究[D].北京：中國農業(yè)大學，2005.

[27] 王穎，馬玲玲，呂欣，等.單一和復配微生物固態(tài)發(fā)酵對卷煙葉組主要化學成分的影響[J].煙草科技，2015，48（11）：47-52.

[28] 李寧，汪長國，曾代龍，等.蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）篩選鑒定及在雪茄煙葉發(fā)酵中的應用研究[J].中國煙草學報，2012，18（2）：65-69.

[29] 馮志珍，陳太春，胡喜懷，等.煙葉表面高效降解蛋白質芽孢桿菌的分離篩選及其鑒定[J].中國煙草學報，2012， 18（1）：101-105.

[30] 鄭勤安.造紙法再造煙葉生產過程中微生物增質劑的應用研究[J].浙江工業(yè)大學學報，2004，32（4）：442-446.

[31] 陳小敏，林影，梁書利.煙葉表面微生物群落結構鑒定及其產酶分析[J].基因組學與應用生物學，2016，35（7）：1760-1766.

[32] HUANG J W，YANG J K，DUAN Y Q，et al.Bacterial diversities on unaged and aging flue-cured tobacco leaves estimated by 16S rRNA sequence analysis[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2010，88（2）：553-562.

[33] 瞿嬌嬌，施鳴，張慶明，等.食品微生物對發(fā)酵煙葉品質的影響[J].貴州農業(yè)科學，2012，40（3）：136-138.

[34] 馬林.利用生物技術改變煙葉化學組分提高其吸食品質和安全性的研究[J].鄭州工程學院學報，2001，22（3）：40-45.

[35] 孫榅淑.硝態(tài)氮含量及硝酸鹽清除劑對煙葉高溫貯藏過程中TSNA形成的影響[D].鄭州：河南農業(yè)大學，2016.

[36] 孫政.降低煙草亞硝胺目的菌的篩選及應用研究[D].武漢：華中農業(yè)大學，2011.

[37] 單宏英，陳德鑫，李晶，等.一株源于醇化煙葉表面高效降解TSNA菌株AS97的分離篩選、鑒定及應用[J].微生物學報，2011（10）：1326-1333.