甘肅省道地藥材黃芪、甘草、板藍根中藥飲片的微生物污染狀況研究

孫 鶯 ，王玉梅 ，何曉英 ，李 莉 ，牟建平 ，徐勤科 ，王亞麗 ，謝親建 ，楊平榮

（1.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730000；2.國家藥監局中藥材及飲片質量控制研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.武警甘肅省總隊醫院，甘肅 蘭州 730050）

中藥飲片是指藥材經過炮制后可直接用于中醫臨床或制劑生產使用的處方藥品。中藥飲片質量直接關系著臨床用藥的安全性、有效性[1]，微生物污染是飲片外源性污染的主要形式之一，也是影響人體健康的重要途徑[2]。藥品微生物控制是藥品安全性保障的重要措施，因此，制定科學合理的中藥飲片微生物限度標準是保證飲片微生物安全的關鍵，也是實現中藥標準引領國際、中藥產業健康發展的關鍵[3]。目前，國外藥品標準如《歐洲藥典》《美國藥典》和《日本藥典》均收載了天然藥（生藥）的微生物檢查方法和限度標準，《中國藥典》2015年版四部[4]通則“1107非無菌藥品微生物限度標準”首次收載了中藥飲片的微生物限度標準，但僅針對研粉口服用貴細飲片、直接口服及泡服飲片規定了沙門菌和耐膽鹽革蘭陰性菌限度標準，暫未規定需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數限度，更沒有其他中藥飲片的微生物限度標準，導致中藥飲片的衛生質量缺乏全面的評價標準，使中藥飲片在應用中存在潛在的安全風險。有研究表明，中藥飲片微生物污染情況比較嚴重，衛生質量亟待提高，微生物限度標準亟待完善[5-9]。甘肅是全國中藥材資源大省，素有“千年藥鄉”之稱，特別是道地藥材種植已形成一定規模，本研究以3種甘肅道地藥材黃芪、甘草、板藍根中藥飲片為研究對象，每種飲片30批共計90批，考查微生物污染狀況，初步掌握微生物污染負載水平，為中藥飲片微生物污染風險評估和微生物標準的制定提供數據支持。

1 試驗材料

1.1 儀器

超凈工作臺（上海蘇凈，SW-CJ-2D）；生物安全柜（ESCD，ClassⅡBSC）；生化培養箱 （上海一恒，BPMJ-250F）；PCR 儀（ABI，Veriti）。

1.2 試劑

pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（批號：20191102）；胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）（批號：20190930）；胰酪大豆胨液體培養基（TSB）（批號：20191212）；沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）（批號：20190912）；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基；腸道菌增菌液體培養基；RV沙門菌增菌液體培養基；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（XLD）（批號：20181124）；三糖鐵瓊脂培養基（TSI）。均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.3 中藥飲片

本研究選取我省3種道地藥材品種黃芪、甘草、板藍根的中藥飲片，每個品種30個批次共計90批次。黃芪來源于甘肅、安徽、河北、陜西、四川的26個不同廠家；甘草來源于甘肅、安徽、北京23個不同廠家；板藍根來源于甘肅、安徽、河北、陜西、四川的26個不同廠家。

2 試驗方法

參照《中國藥典》2015年版中“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法”（通則 1105）和“非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法”（通則1106）進行檢查[9]。

2.1 供試品溶液的制備

稱取10 g樣品，加入100 ml pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液中，振蕩，制成1∶10供試品溶液。

2.2 需氧菌總數（TAMC）的測定

取“2.1”中1∶10供試液，用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液10倍稀釋至10-5，采用平皿法計數，1 mL/皿，平行制備2個平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，33℃培養5 d。

2.3 霉菌和酵母菌總數（TYMC）的測定

取“2.1”中1∶10供試液，用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液10倍梯度稀釋至10-4，采用平皿法計數，1 ml/皿，平行制備2個平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，23℃培養7 d。

2.4 控制菌的檢查

2.4.1 耐膽鹽革蘭陰性菌（Bile-tolerant Gram-negitive Bacteria，BGB） 取“2.1”中 1∶10 供試液，按照 2015 年版《中國藥典》四部通則“微生物計數法”[9]進行耐膽鹽革蘭陰性菌的定量檢查和定性檢查。取10-1、10-2和10-3供試品稀釋液1 mL分別接種至10 mL腸道菌增菌液體培養基中，35℃下培養48 h。取相當于1 g樣品的上述預培養物接種至100 mL腸道菌增菌液體培養基中，33℃培養24 h后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上，33℃培養24 h。

2.4.2 沙門菌 取飲片樣品10 g，接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，33℃下培養48 h。取上述培養物0.1 mL接種至10 mL RV沙門菌增菌液體培養基中，33℃下培養48 h。取少量RV沙門菌增菌液體培養物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上，33℃下培養48 h。

2.5 菌種鑒定

從“2.4.1”中的紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板和“2.4.2”中的木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板選取不同典型形態的微生物，進行菌株的分離純化，PCR擴增16s rRNA基因，以27F和1492R為引物，進行16s rRNA片段擴增，將擴增片段進行測序（通用生物測序），將所測得的16s rRNA基因序列用BLAST軟件進行相關序列的對比，確定分離純化所得到的細菌的種屬。

3 結果

3.1 需氧菌總數檢測結果

將需氧菌總數（TAMC）的結果取對數（以lgTAMC表示），分別以90批飲片樣品的lgTAMC值為橫坐標、lgTAMC頻數為縱坐標做直方圖和分布曲線，結果見圖1。以黃芪、甘草、板藍根各30批的飲片樣品的lgTAMC值為橫坐標、lgTAMC頻數為縱坐標做直方圖和分布曲線，結果見圖2～4。本次試驗所選取的90個批次中藥飲片均檢出需氧菌，lgTAMC的均值為3.573，最小值為2.021，最大值為5.989，見表1。由圖1可知，90批飲片樣品的lgTAMC值呈偏態分布。90批飲片樣品的lgTAMC值均小于6.0，整體水平符合歐洲、日本、美國藥典標準，各國藥典與中藥飲片相當的植物藥或生藥的微生物限度值見表2。

表1 飲片樣品TAMC和TYMC測定結果

表2 各國藥典與中藥飲片相當的植物藥或生藥的微生物限度值

由圖2～4可知，3種中藥飲片中，黃芪的需氧菌污染程度最高，板藍根需氧菌污染程度最低，其中黃芪中需氧菌總數最高值達106cfu/g。黃芪飲片樣品的lgTAMC值為2.021～5.035，甘草飲片樣品的 lgTAMC值為 2.114～5.106，板藍根飲片樣品的lgTAMC值為2.477～5.989，不同批次中藥飲片微生物污染情況各不相同，其中板藍根各批次間需氧菌總數差別尤為明顯，這種差別最高達3.5個數量級。

圖1 所有飲片樣品lgTAMC直方圖和分布曲線

圖2 黃芪飲片樣品lgTAMC直方圖和分布曲線

圖3 甘草飲片樣品lgTAMC直方圖和分布曲線

圖4 板藍根飲片樣品lgTAMC直方圖和分布曲線

3.2 霉菌和酵母菌總數檢測結果

將霉菌和酵母菌總數（TYMC）的結果取對數（以lgTYMC表示），以90批飲片樣品的lgTYMC值為橫坐標、lgTYMC頻數為縱坐標做直方圖和分布曲線，結果見圖5。以黃芪、甘草、板藍根各30批的飲片樣品的lgTYMC值為橫坐標、lgTYMC頻數為縱坐標做直方圖和分布曲線，結果見圖6～8。

90批飲片樣品均檢出霉菌和酵母菌，lgTYMC的均值為1.963，最小值為0.699，最大值為4.161，見表1。由圖5可知，lgTYMC值呈偏態分布，其中超過70%的lgTYMC值為0.5～1.5，超過99%的lgTYMC值小于4.0，符合美國、歐洲、日本藥典標準。全部飲片lgTYMC值小于5.0，整體水平符合歐洲、美國藥典標準。只有1批板藍根lgTYMC值大于4.0，小于5.0，不符合《美國藥典》要求。由圖6～8可知，3種中藥飲片中，霉菌和酵母菌污染程度黃芪最高，板藍根最低，其中黃芪中霉菌和酵母菌最高值達104cfu/g。黃芪飲片樣品的lgTYMC值為1.000～3.161，甘草飲片樣品的 lgTYMC值為0.699～3.114，板藍根飲片樣品的lgTYMC值為0.699～4.161，不同批次中藥飲片微生物污染情況各不相同，其中板藍根各批次間霉菌和酵母菌數差異最大，質量最不穩定，這種差別最高達3.5個數量級。

圖5 所有飲片樣品lgTYMC直方圖和分布曲線

圖6 黃芪飲片樣品lgTYMC直方圖和分布曲線

圖7 甘草飲片樣品lgTYMC直方圖和分布曲線

圖8 板藍根飲片樣品lgTYMC直方圖和分布曲線

3.3 控制菌測定結果

3.3.1 耐膽鹽革蘭陰性菌 耐膽鹽革蘭陰性菌將N值進行轉化，N＜10 轉化為 0.5，10＜N＜1×100 轉化為 1.5，1×100＜N＜1×1 000轉化為2.5，N＞1×1 000轉化為3.5，轉化數值做的直方圖和分布曲線見圖9。90批中藥飲片中，44批檢出耐膽鹽革蘭陰性菌，占48.9%，其中黃芪17批，甘草20批，板藍根7批，分別占各自批數的56.7%、66.7%、23.3%。不同批次和來源的同種飲片耐膽鹽革蘭陰性菌差別很大。

圖9 所有飲片樣品耐膽鹽革蘭陰性菌直方圖和分布曲線

3.3.2 沙門菌檢測 經檢驗，90批飲片中檢出沙門菌2批，都是甘草飲片，不符合各國藥典標準。沙門菌被認為是目前世界范圍內最重要的食源性致病菌之一，需要引起關注。

3.4 菌種鑒定結果

挑取平板上的典型菌落，16s rRNA鑒定結果見表3。不同飲片品種中污染的微生物分布于4個科，8個屬。其中檢出比例最高的為腸桿菌科和芽孢桿菌科，其次為纖維桿菌科和乳桿菌科。不同飲片樣品中檢出的污染微生物種類具有明顯的差異，板藍根中檢出4種典型污染菌，黃芪和甘草中各檢出3種典型污染菌。值得注意的是，從中藥飲片中檢出了陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌這些重要的條件致病菌，檢出芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬等耐熱微生物，這些細菌為環境中常見細菌，可能在種植和生產加工環節引入，而芽孢桿菌屬細菌較難殺滅。因此，對于一些沖泡或直接服用的飲片，存在一定的用藥風險。

4 討論

4.1 中藥飲片微生物污染情況

甘肅省是中藥材資源大省，黃芪、甘草、板藍根為甘肅道地大宗中藥材，均屬于未經炮制處理的藥材，需要煎煮服用。90批飲片需氧菌總數平均值高于103cfu/g，最大值達106cfu/g；霉菌及酵母菌總數平均值達到102cfu/g，最大值超過104cfu/g。耐膽鹽革蘭陰性菌檢出率48.9%，檢出沙門菌2批，都是甘草飲片。黃芪的微生物污染程度最高，板藍根污染程度最低。按照《中國藥典》2015年版要求，不合格率為2.2%

4.2 基于微生物污染情況的建議

本研究發現飲片微生物負載水平較高，衛生狀況欠佳，中藥飲片中污染的需氧菌和耐膽鹽革蘭陰性菌數量較大，雖然通過傳統的加工炮制方法如煎煮、熬制等能消除飲片中部分微生物對人體健康的直接威脅，但微生物的生長代謝對中藥飲片的有效成分、藥效會帶來不可逆的轉變。因此，全面加強中藥飲片微生物污染的控制，是加強外源性污染物控制、提高中藥飲片臨床使用安全的重要工作之一。我國中藥飲片微生物標準與發達國家存在一定差距，嚴重制約中藥產業走向世界。基于本研究結果，建議進一步開展中藥飲片微生物危害的風險評估工作，建議根據中藥飲片的入藥部位、藥性、炮制工藝等建立合理的微生物限度標準，引導生產企業加強過程控制，逐步規范中藥飲片生產、儲運的各環節，降低微生物負荷和中藥飲片的安全風險，既可以加強藥品質量安全，又能為促進中藥飲片產業的健康發展起到積極作用。

表3 菌種鑒定結果