外泌體在抗結(jié)核感染疫苗開發(fā)中的作用研究進展

高佳慧，耿 建

（蚌埠醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030）

結(jié)核病（TB）是威脅人類健康的全球衛(wèi)生問題。隨著抗結(jié)核藥物的相繼問世，特別是兒童接種卡介苗后，結(jié)核病的發(fā)病率大幅度降低。但結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)以及艾滋病發(fā)病率的增加使得結(jié)核病有“死灰復(fù)燃”之勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，我國是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，也是全球27個耐多藥結(jié)核病（MDRTB）高負(fù)擔(dān)國家之一[1]。耐藥結(jié)核的防治是我國亟待解決的難題。外泌體（exosomes）是機體大多數(shù)細(xì)胞能夠分泌的具有脂質(zhì)雙層膜的納米級囊泡結(jié)構(gòu)。外泌體可以激活多種細(xì)胞因子，并且作為巨噬細(xì)胞感染結(jié)核分枝桿菌后呈遞特異性抗原的載體[2]。另外，外泌體可以作為生物標(biāo)志物和藥物載體在腫瘤的診斷與治療方面發(fā)揮作用[3]。外泌體對結(jié)核分枝桿菌的作用是開發(fā)抗結(jié)核感染疫苗的一個方向，更多的研究者瞄準(zhǔn)該方向以探求更好的診斷和治療結(jié)核病的方法。本文就最新的相關(guān)成果進行總結(jié)并對外泌體對結(jié)核分枝桿菌的作用進行綜述。

1 外泌體

1.1 生物學(xué)特性

細(xì)胞外囊泡（EVs）是經(jīng)由旁分泌得到的納米級顆粒，主要包括外泌體（exosome）、微囊泡（microvesicle）、膜囊泡-凋亡小體（appoticbody）[4-7]，參與細(xì)胞間的信息交流。Théry 等[8]在 2018 年對其進行了更為準(zhǔn)確的劃分，將細(xì)胞外囊泡直徑小于200 nm的稱為medium/large EVs，直徑小于100 nm的稱為small EVs。外泌體是一種直徑約為30～150 nm的微小的盤型囊泡。1983年，外泌體第一次在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，1987年Johnstone將其命名為exosome[9]。但在之前外泌體并沒有得到人們的重視，被看作是一種細(xì)胞廢棄物。因此，外泌體的相關(guān)結(jié)構(gòu)與功能并未被挖掘。幾乎所有類型的細(xì)胞在正常和病理狀態(tài)下包括腫瘤細(xì)胞均可以分泌外泌體，其可以攜帶多種蛋白質(zhì)、DNA、RNAs（微小RNA、環(huán)狀RNA、長鏈非編碼RNA等）、脂質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子等生物分子。外泌體作為這些物質(zhì)的載體，是細(xì)胞與細(xì)胞之間傳遞生物信息的介質(zhì)，在細(xì)胞間的通訊過程中起著重要的作用。作為一種天然載體，外泌體存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁，通過內(nèi)體途徑形成主要來源于與溶酶體相關(guān)的多囊泡體，然后通過膜融合釋放到細(xì)胞外基質(zhì)，見圖1。外泌體表面含有豐富的鞘磷脂、膽固醇等脂質(zhì)類物質(zhì)。外泌體中含有多種功能蛋白質(zhì)，例如RAB蛋白、膜聯(lián)蛋白、熱休克蛋白家族（HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2、HSP90）以及 A33、MHC-Ⅱ、CD86、CD63、CD9等。某些外泌體蛋白質(zhì)可以作為一種生物標(biāo)志物在機體的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。外泌體的表面還含有與肺癌密切相關(guān)的隸屬于非編碼RNAs（ncRNAs）[10]的miRNA[11]。相關(guān)研究表明[12]，外泌體在低氧 TME（TME）內(nèi)調(diào)解如癌細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞等各種細(xì)胞類型間的雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在腫瘤侵入、血管生成、免疫逃避中起著重要作用。

1.2 外泌體的標(biāo)記與分離

外泌體與腫瘤治療的相關(guān)性已經(jīng)成為當(dāng)下的研究熱點之一。對外泌體的標(biāo)記與分離是研究外泌體結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)鍵步驟。外泌體可以通過化學(xué)修飾、適體親和力、兩親性分子插入等方法進行標(biāo)記。相關(guān)研究表明可以通過超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法、體積排阻色譜、免疫親和法等方法對外泌體進行分離[13]，也有研究提出利用微流控及外泌體膜的相關(guān)性質(zhì)來實現(xiàn)對外泌體的分離[14]。近年來還出現(xiàn)了與外泌體相關(guān)的蛋白分析新方法，較為典型的有小顆粒流式細(xì)胞儀、微核磁共振等離子外泌體（nPLEX）傳感器和高敏感ExoScreen技術(shù)。另外，有相關(guān)研究創(chuàng)造性地提出了利用ExoTIC（外異性全隔離芯片）從癌癥患者臨床樣本中分離EVs，這種方法便捷易行具有廣泛的使用性。更有研究者提出構(gòu)造人工囊泡（MIMV）來實現(xiàn)對外泌體的相關(guān)性研究。

圖1 外泌體參與細(xì)胞間信息交流的4種途徑[13]

2 結(jié)核分枝桿菌的生物學(xué)特性與耐藥機制

2.1 生物學(xué)特性

結(jié)核分枝桿菌（Mtb）是引起人類結(jié)核感染的最常見原因。可以侵犯各器官，其中呼吸道感染引起的肺結(jié)核最為常見。Mtb的致病物質(zhì)與其菌體成分如莢膜、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)有關(guān)，其中包括索狀因子、磷脂、硫酸腦苷脂、蠟質(zhì)D在內(nèi)的糖脂尤為重要。Mtb是一種胞內(nèi)感染菌，機體對Mtb的免疫主要是以T淋巴細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫。目前，臨床上通過結(jié)核菌素皮膚試驗、抗原檢測、分子生物學(xué)鑒定、抗結(jié)核抗體（lgG）檢測等方法進行鑒定。在最近的研究中，Cancino-Muoz I[15]等利用高分辨率的實時PCR、Sanger測序等技術(shù)鑒定了人和牛宿主的491個樣本，提出了SNP的方法來治療基因型結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌株。Shin S等[16]對用于檢測結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的GENEDIA MTB/NTM試劑盒的診斷性能進行了評估。

2.2 耐藥機制

近年來，結(jié)核病“死灰復(fù)燃”并在全球大范圍流行，還出現(xiàn)了耐藥菌株。WHO統(tǒng)計指出中國每年結(jié)核新發(fā)病例在90萬例左右，新發(fā)耐藥結(jié)核患者約5.8萬例[1]。結(jié)核病易感者及攜帶者是防治結(jié)核的重中之重。結(jié)核分枝桿菌的耐藥機制尚未研究透徹，而耐多藥結(jié)核病的出現(xiàn)無疑給Mtb研究者帶來新的挑戰(zhàn)。

合理的化學(xué)藥物治療是控制結(jié)核病發(fā)展、復(fù)發(fā)及抑制耐藥性產(chǎn)生的關(guān)鍵。目前用于臨床的一線抗結(jié)核藥包括異煙肼、利福平、乙胺丁醇等。但隨著藥物的長期使用，新發(fā)耐多藥結(jié)核病層出不窮。抗結(jié)核藥的作用機理主要是通過阻礙結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁、RNA以及蛋白質(zhì)的合成，干擾結(jié)核分枝桿菌的生物代謝等來發(fā)揮作用。導(dǎo)致Mtb耐藥的主要原因之一是基因突變。有研究表明[17]，結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥的一個重要方面就是katG基因的突變。除此之外，inhA基因發(fā)生突變以及ndh等基因的突變也是引起異煙肼耐藥的重要原因。另外，相關(guān)研究指出rpob基因突變可以導(dǎo)致大約95%利福平耐藥菌株的出現(xiàn)，編碼阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶的embABC操縱子基因突變可以導(dǎo)致Mtb對乙胺丁醇耐藥，而細(xì)胞壁滲透性下降也是Mtb耐藥的一個重要方面。另外研究[18]指出目前貝達(dá)喹啉、利奈唑胺、德拉馬尼是耐多藥結(jié)核的有效藥物。耐藥菌株的出現(xiàn)導(dǎo)致耐多藥結(jié)核病的發(fā)展迅猛，使得打贏結(jié)核病的防治攻堅戰(zhàn)更為艱難。

3 外泌體與結(jié)核分枝桿菌的相互作用

Mtb感染機體會激活機體相關(guān)的免疫應(yīng)答。機體對Mtb的免疫主要是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。過往的研究指出在此細(xì)胞免疫中起到關(guān)鍵作用的是巨噬細(xì)胞。Smith等[19]研究發(fā)現(xiàn)被Mtb感染的小鼠巨噬細(xì)胞釋放的外泌體可以顯著影響T細(xì)胞應(yīng)答。用BCG感染人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞（MDMs）可導(dǎo)致包括miR-155、miR-146a、miR-145 和 miR-21 在內(nèi)的多種 miRNA的釋放，這些miRNA被預(yù)測是與免疫相關(guān)的重要靶向基因。

3.1 抗原提呈作用

巨噬細(xì)胞具有識別結(jié)核分枝桿菌的能力，同時巨噬細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌寄生的場所。巨噬細(xì)胞識別結(jié)核分枝桿菌主要通過Toll樣受體（TLR）進行，TLRs是跨膜蛋白受體，主要在單核巨噬細(xì)胞表面進行表達(dá)。另外，與巨噬細(xì)胞識別結(jié)核分枝桿菌相關(guān)的受體還包括NOD樣受體、C型凝集素受體等。結(jié)核分枝桿菌與機體巨噬細(xì)胞接觸被巨噬細(xì)胞吞噬后被細(xì)胞質(zhì)膜包裹，與此同時巨噬細(xì)胞形成溶酶體，其內(nèi)的溶菌酶、蛋白酶等物質(zhì)可以將結(jié)核分枝桿菌的各種蛋白降解，得到易于轉(zhuǎn)運的短肽片段。此時，主要組織相容性復(fù)合物（MHC）合成MHCs來發(fā)揮提呈活性成分和抗原的功能。MHC-Ⅰ類及MHC-Ⅱ類分子[20]將這些短肽片段呈遞給巨噬細(xì)胞從而可以分別激活免疫系統(tǒng)的CD8+T、CD4+T淋巴細(xì)胞。其中CD4+T細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是主要的免疫應(yīng)答。在進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體后，小分子被轉(zhuǎn)運到巨噬細(xì)胞表面，被CD8+T細(xì)胞識別。同時CD8+T細(xì)胞可以釋放穿孔素和顆粒酶，進行誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的機制Fas/FasL殺傷結(jié)核分枝桿菌。巨噬細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌的固有免疫系統(tǒng)中有重要的作用，例如TLR2[21]可以借助于其他的Toll樣受體識別結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的糖脂類成分以此來在固有免疫中發(fā)揮作用。此外，巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核分枝桿菌利用胞內(nèi)消化酶來殺傷結(jié)核桿菌，結(jié)核的感染可劃分為3個階段：無癥狀清除、潛伏感染、出現(xiàn)臨床疾病。

3.2 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子[22]在T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫中扮演著重要角色。巨噬細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌和其他生物因子的作用下可以分泌多種細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)抗原提呈作用。如TNF-α、IL-1、IL-8、IL-12和IFN-γ等。TNF-α可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，通過抑制結(jié)核分枝桿菌的生長來介導(dǎo)抗結(jié)核免疫。IL-12在增強Th1型細(xì)胞免疫與特異性免疫關(guān)系中具有重要作用。IFN-γ、炎癥細(xì)胞因子參與了肺結(jié)核的感染免疫[23]。巨噬細(xì)胞分泌的外泌體可以阻礙天然巨噬細(xì)胞的INF-γ途徑的激活，抑制小鼠巨噬細(xì)胞表面MHCⅡ類和CD64分子的表達(dá)。另外，外泌體具有激活巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和初始CD4+T、CD8+T[24]細(xì)胞的能力。抗原刺激引起CD4+T細(xì)胞活化，活化后的CD4+T細(xì)胞可以釋放細(xì)胞因子IFN-γ，它可以促進機體特異性地殺傷結(jié)核分枝桿菌，從而發(fā)揮保護性免疫來抗結(jié)核分枝桿菌的感染。巨噬細(xì)胞感染結(jié)核分枝桿菌后，可以產(chǎn)生羥自由基、過氧化氫和超氧陰離子等自由基。這些自由基可以破壞Mtb的核酸多糖導(dǎo)致DNA突變，從而抑制結(jié)核分枝桿菌的殺傷作用。除此之外，宋群等[25]選取33例耐藥肺結(jié)核、49例普通肺結(jié)核及51例健康志愿者展開對比，研究得出Th17/CD4+CD25+Foxp3+T平衡與結(jié)核病的發(fā)生與耐藥結(jié)核病的產(chǎn)生密切相關(guān)。另外有研究者[26]在實驗時將Mtb感染的Rab27a缺陷小鼠與野生型小鼠相比，發(fā)現(xiàn)其外泌體產(chǎn)量減少，抗原特異性T細(xì)胞激活就減少，控制Mtb感染的能力下降，從而可以看出外泌體對特異性T細(xì)胞免疫的影響。

4 外泌體疫苗的開發(fā)

如今廣泛用于治療結(jié)核病的疫苗的是卡介苗（BCGVaccine），是唯一獲得許可使用的減毒活疫苗[27]。研究表明，BCG的親本株為牛型分枝桿菌，失去了編碼毒力因子的RD1區(qū)。新生兒接種卡介苗很大程度降低了結(jié)核病的發(fā)病率，可以預(yù)防兒童結(jié)核性腦膜炎和播散性結(jié)核病，但不能預(yù)防成年人感染MTB。所以，對于目前防治結(jié)核病的狀況，需要進一步加強對抗結(jié)核感染藥物研發(fā)。目前，市場和臨床試驗的抗結(jié)核疫苗大致分為三類[28]：基礎(chǔ)性免疫疫苗、增強性免疫疫苗、TB治療疫苗。其中VPM 1002是BCG的一個重組株，研究者利用48例新生兒進行臨床試驗證實VPM1002在安全性和耐受性上有很好的效果。MTBVAC也是一種直接用于減毒的疫苗。相關(guān)的疫苗還包括Ad35/Aeras40、Hybrid 1-IC31、Ruti疫苗、SRL-172 疫苗、DAR-901等。隨著對外泌體研究的不斷深入，外泌體作為生物標(biāo)志物和天然載體的功能在腫瘤治療、冠心病、感染性疾病的作用與日俱增。外泌體miR-21可以通過多種方式影響HCC細(xì)胞的生長，血漿miR-452[29]可以作為胃癌的生物標(biāo)志物，外泌體miRNA可作為肺癌[11，30]診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。這些都為我們研究外泌體抗結(jié)核感染的疫苗提供了方向。

有研究指出納米載體可向腫瘤細(xì)胞提供藥物用于腫瘤的藥物治療且外泌體的miRNAs[31]有成為癌癥診斷標(biāo)志物的潛能。隨著對結(jié)核發(fā)病機理的深入研究，阻礙結(jié)核病的發(fā)病過程可降低結(jié)核病的發(fā)病率。納米載體無疑為治療結(jié)核病提供了一個研究方向，那就是作為藥物載體來輸送靶向藥物治療結(jié)核病，甚至是用于輸送核酸。Xu等[32]已成功開發(fā)出一種新的ROS響應(yīng)性和腫瘤穿透性多前體藥物納米平臺，用于靶向癌癥治療。

5 展望

對于目前TB感染和防控的現(xiàn)狀，雖然存在抗結(jié)核的相關(guān)藥物并且臨床新藥物的研究也有所進展，但耐多藥結(jié)核菌株難保不會對這些藥物再次產(chǎn)生耐藥性。因此，需要進一步加強對MTB感染和抗MDR-TB的基礎(chǔ)研究，積極研制新型治療MDRTB患者的藥物。另外，結(jié)核分枝桿菌感染是引起艾滋病（AIDS）患者最常見的機會性感染和病死的原因[31，33]。但外泌體的研究還處于初級階段，并且Mtb逃避宿主細(xì)胞免疫監(jiān)視和清除機制尚未明確。雖然外泌體對腫瘤治療的作用研究有所進展，但外泌體抗結(jié)核感染疫苗的開發(fā)之路還很漫長。還有一點就是，相關(guān)的研究指出EV miRNA的分析還很欠缺[34]。