紅棗分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用研究進展

薄璇，侯艷霞，常寧

（山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西太原 030009）

棗為藥食同源的植物，營養(yǎng)豐富，素有“百果之王”的稱號，是很多地區(qū)重要的經(jīng)濟作物[1-2]。目前棗樹分類及優(yōu)良品種鑒別常用的方法是形態(tài)及細(xì)胞標(biāo)記，容易產(chǎn)生同物異名、同名異物的現(xiàn)象[3-4]，使分類及良種鑒別的結(jié)果不準(zhǔn)確。由于棗樹去雄難，人工選育的雜交種不易獲得雜交后代，無法有效獲得實生苗的父母本信息，使棗樹品種改良及定向選育存在較大困難[5]，因此如何快速地對棗樹進行分類并鑒別出優(yōu)良品種，已成為我國棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟需解決的問題。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，基于遺傳物質(zhì)DNA 的分子標(biāo)記技術(shù)在棗的指紋圖譜構(gòu)建分類上顯示出了優(yōu)越性。分子標(biāo)記是一種基于PCR 反應(yīng)的技術(shù)，目前常見的有簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）、隨機擴增多態(tài)性DNA（Randomamplified polymorphic DNA，RAPD）[6]、區(qū)間簡單重復(fù)（Inter-simple sequence repeat，ISSR）[7-9]及擴增片段長度多態(tài)性 （Amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術(shù)。相比于原來的形態(tài)及細(xì)胞標(biāo)記，分子標(biāo)記具有不受環(huán)境季節(jié)影響、數(shù)量多、共顯性等諸多優(yōu)點。目前DNA 分子標(biāo)記技術(shù)在棗種遺傳圖譜的構(gòu)建、親緣關(guān)系、遺傳多樣性、物種鑒定及育種等方面都有應(yīng)用。本文就近年來分子標(biāo)記技術(shù)在紅棗種質(zhì)資源及遺傳育種中的相關(guān)研究進展進行了綜述，以期為棗屬資源開發(fā)及育種提供參考。

1 紅棗分子標(biāo)記概述

分子標(biāo)記技術(shù)為PCR 中的一種，擴增的效率及特異性受到DNA 質(zhì)量、引物及反應(yīng)體系濃度的綜合影響。因此如何獲得高質(zhì)量的DNA，選擇合適的反應(yīng)體系是分子標(biāo)記技術(shù)首先需要解決的問題。由于分子標(biāo)記反應(yīng)是在引物的作用下，以DNA 為模板，dNTPs 為底物，Mg2+與其形成復(fù)合物的PCR 反應(yīng)，擴增效果受到引物、反應(yīng)體系的影響[10]，因此針對不同的棗屬，需要先研究影響分子標(biāo)記試驗的因素。

在紅棗分子標(biāo)記試驗中，首先引物的要求是擴增出的DNA 條帶清晰、高度多態(tài)性。引物開發(fā)方面可以直接以棗的組織為材料。陳杰敏等[11]以冬棗葉綠體基因組為材料，設(shè)計了11 對冬棗的SSR 引物，利用轉(zhuǎn)錄組開發(fā)SSR 引物。周軍永等[12]利用轉(zhuǎn)錄組來源的SSR 分析了李府貢棗基因序列，并分析了單核苷酸及多核苷酸的出現(xiàn)比例，表明李府貢棗中SSR 標(biāo)記數(shù)量多，為SSR 引物及構(gòu)建棗的遺傳結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。谷振軍等[13]對南酸棗葉片和果實轉(zhuǎn)錄組高通量分析后，根據(jù)多個SSR 位點，分析了重復(fù)核苷酸所占的比例，以此為基礎(chǔ)設(shè)計了150 對引物。

其次，紅棗分子標(biāo)記反應(yīng)體系中物質(zhì)濃度對擴增效果也存在影響。dNTPs 作為反應(yīng)的底物，濃度低將降低產(chǎn)量；過高則降低Mg2+的有效濃度[14]。Mg2+濃度過高，出現(xiàn)假陽性非特異性條帶[15]；過低則擴增產(chǎn)量較少。引物濃度太低時，擴增產(chǎn)物少；過高時會出現(xiàn)二聚體，或由于模板與引物錯配，使條帶模糊及產(chǎn)生新的特異性位點[16]。齊靖等[17]以冬棗為試驗材料，單因素分析了ISSR-PCR 體系中物質(zhì)濃度及溫度的影響，得到了棗屬植物最適的體系。在其基礎(chǔ)上，申潔等[18]在2010 年通過正交法分析了反應(yīng)體系中各物質(zhì)的濃度對擴增結(jié)果的影響，得出濃度對體系的影響順序為Mg2+＞dNTPs＞Taq 聚合酶=引物，體系Mg2+濃度與齊靖等[17]研究結(jié)果一致。王延峰等[19]以陜北11 種棗為材料，研究了Taq 聚合酶單位數(shù)、引物濃度對體系的影響，Taq 聚合酶單位數(shù)為0.06 U/μL，引物濃度為0.4 μ mol/L，與齊靖等[17]的研究結(jié)果一致。

2 分子標(biāo)記在紅棗遺傳多樣性及育種方面的應(yīng)用

2.1 構(gòu)建棗的遺傳圖譜

構(gòu)建遺傳圖譜是遺傳學(xué)中的重要內(nèi)容，在此基礎(chǔ)上進行基因組的系統(tǒng)研究、品種分類及物種的鑒別選育。目前，已有多個棗基因組學(xué)研究表明已構(gòu)建了一些棗遺傳圖譜，并已經(jīng)把部分基因定位于圖譜上。如麻麗穎等[20]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了36 份棗的指紋圖譜，該課題組從北京林業(yè)大學(xué)棗樹育種和栽培實踐基地搜集到36 個棗品種，進行葉片DNA 提取，利用12 對SSR 引物構(gòu)建了指紋圖譜，聚類分析結(jié)果表明棗的遺傳多樣性相對較小。文亞峰等[21]首先優(yōu)化了AFLP 的熒光體系，然后對山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹園藝所及湖南省茶陵縣26 個棗的優(yōu)良品種及1 個酸棗品種進行了遺傳圖譜分析，在該體系下得到了清晰的不同擴增條帶，建立了棗的指紋圖譜。

2.2 親緣關(guān)系判斷及分類

分子標(biāo)記技術(shù)是通過對DNA 進行聚類分析來實現(xiàn)對棗種親緣關(guān)系及來源的研究，從而對棗進行準(zhǔn)確高效的分類。分子標(biāo)記是一種檢測種質(zhì)資源多樣性的有效工具，其數(shù)據(jù)不僅可以反映物種系統(tǒng)的演化，而且可以對物種和品種親緣關(guān)系進行分類。

分子標(biāo)記技術(shù)可以通過多態(tài)性，有效分析樣本間的親緣關(guān)系，對樣品進行分類。王斯琪等[22]用SSR 鑒定了自然授粉的冬棗1 728 株和530 株“靈寶大棗”子代苗父本。從376 對引物中篩選出了8 對引物，8 對引物在親本中檢測到45 個多態(tài)等位條帶，PIC 平均為0.71。這說明分子標(biāo)記技術(shù)可以有效地在品種間分析父本的親緣關(guān)系。原勤勤等[23]對38 種棗進行了遺傳多樣性分析，得出多態(tài)性比率為88.47%，這說明38 種棗的遺傳多樣性豐富。遺傳相似系數(shù)為0.436～0.880，酸棗與木棗為0.436，說明品種差異較大，親緣關(guān)系遠(yuǎn)。陳佳瑛等[24]運用ISSR技術(shù)對毛葉棗種的親緣關(guān)系進行研究，得出21 個毛葉棗的多態(tài)性比率為85.7%，說明遺傳多樣性豐富。進一步的聚類分析可以將21 個品種分為3 類，并且大多數(shù)品種間的相似性大于0.67，說明毛葉棗的親緣關(guān)系較近。王永康等[25]運用AFLP 分析了山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國家棗種資源圃中的28 個品種，發(fā)現(xiàn)5 對引物擴增后的結(jié)果多態(tài)率為76.16%，聚類分析后能夠?qū)⑵贩N全部分開。智福軍等[26]優(yōu)化了RAPD 反應(yīng)體系，以12 對引物分別對5個棗品種進行了鑒定，聚類分析后表明5 個品種可以分為2 類，同一類間各品種具有一定的差異，但也具有一定的相關(guān)性，結(jié)果表明分子標(biāo)記技術(shù)可以用于分析不同品種間的親緣關(guān)系的相關(guān)性和差異性。可見，通過分子標(biāo)記技術(shù)中多態(tài)性比率和等位基因的數(shù)量可以有效地分析樣本間的遺傳多樣性、品種差異及親緣關(guān)系。

分子標(biāo)記技術(shù)還可以通過分析多態(tài)性，對不同地區(qū)的樣品之間的親緣關(guān)系進行研究，進而反映了物種演化的過程。喇菲菲等[27]利用SSR 分析技術(shù)對華北、華中、華東及西北地區(qū)的84 個棗品種進行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明華北與華東地區(qū)親緣關(guān)系最近。陳曉軍等[28]對寧夏中寧、同心、靈武3 個地區(qū)栽培的27 個棗品種進行RAPD 分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16 條引物可以準(zhǔn)確地將其分類，聚類結(jié)果表明同心圓棗與靈武長棗、中寧圓棗親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，靈武長棗同中寧圓棗親緣關(guān)系較近。喬勇等[29]應(yīng)用AFLP 分析了河北省滄縣紅棗良繁基地和山西省果樹研究所國家棗種質(zhì)資源圃的21 個棗品種，聚類分析結(jié)果表明21 個品種可分為6 類，相似系數(shù)最大的金絲小棗和無核小棗為0.94，表明兩種棗的親緣關(guān)系非常接近。魏天軍等[30]利用AFLP 標(biāo)記分析了寧夏回族自治區(qū)的8 個棗樹品種品系和原產(chǎn)甘肅靖遠(yuǎn)縣的1 個棗樹品種的親緣關(guān)系，利用5 對引物進行分析發(fā)現(xiàn)，多態(tài)性為27.89%，親緣關(guān)系不豐富。李白云等[31]對7 份寧夏的紅棗品種和6 個從區(qū)外引進的品種親緣關(guān)系分析，使用5 對引物擴增了13 個寧夏紅棗種質(zhì)資源，得到了301 條多態(tài)帶（占85.75%），并得出材料間的遺傳相似系數(shù)為0.376～0.957。聚類分析的13 個品種可以分為5 類，結(jié)果表明寧夏地區(qū)紅棗親緣關(guān)系近。分子標(biāo)記技術(shù)可以有效地分析不同地區(qū)之間棗的遺傳關(guān)系。

2.3 研究遺傳多樣性

遺傳多樣性是種質(zhì)資源利用及保護的基礎(chǔ)，分子標(biāo)記技術(shù)可以快速有效地研究某地區(qū)棗種的遺傳結(jié)構(gòu)。利用分子標(biāo)記技術(shù)開展紅棗DNA 水平上的遺傳變異研究，同時結(jié)合經(jīng)典生物學(xué)方法，能為澄清和解決紅棗一些分類差異和遺傳背景問題提供分子依據(jù)。殷曉等[32]利用SSR技術(shù)分析了陜北54 份棗種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，陜北棗屬于中度雜合，遺傳多樣性豐富，供試品種交流頻繁，遺傳多樣性與品種有密切的關(guān)系。該課題組于2013年繼續(xù)對陜西黃河沿岸的酸棗進行分析，結(jié)果表明，酸棗的群內(nèi)變異遠(yuǎn)大于群體間變異，群體間基因流指數(shù)較高。得到黃河沿岸酸棗遺傳多樣性豐富，變異程度較高的結(jié)論，為酸棗種質(zhì)保存提供了依據(jù)[33]。刁毅等[34]利用RAPD技術(shù)對安國棗、龍棗、沾化冬棗、野棗、胎里紅、灰棗、酸棗等11 類棗進行品種遺傳關(guān)系測定，利用12 個引物擴增條帶后聚類分析結(jié)果得到，親緣關(guān)系遠(yuǎn)近順序為野棗＞臺灣青棗＞龍棗及其他品種。

2.4 物種鑒定及育種

分子標(biāo)記技術(shù)可以快速地鑒別新物種的來源、同一物種在不同地區(qū)品質(zhì)的變化原因及找到新品種中優(yōu)良基因，為下一步育種提供分子基礎(chǔ)。孫學(xué)超等[35]根據(jù)SSR 帶型的差異，分析了不同雜交組合時雄性不育種質(zhì)育性，說明分子標(biāo)記技術(shù)可以快速鑒定雜種。孟曉燁等[36]對來源于山東省樂陵市的30 個棗品種進行遺傳圖譜構(gòu)建和聚類分析，從64 對引物中篩選出8 對引物，擴增出1 178個條帶，多態(tài)性比率為97.48%，聚類分析后得到平均值為0.566 3，說明了新品種與原有品種的遺傳差別，為進一步研究棗的成熟及抗裂果基因奠定了基礎(chǔ)。上述試驗表明分子標(biāo)記技術(shù)可以分析棗間遺傳多樣性、快速找到新品種的優(yōu)良基因，為育種提供強有力的理論依據(jù)。

分子標(biāo)記不僅可以快速鑒別新物種，而且還可以對已有棗屬進行物種鑒定。李繼東等[37]應(yīng)用ISSR 技術(shù)對河南栽培的9 個品種進行了分析，得出棗種之間存在著較高的遺傳多樣性，說明分子標(biāo)記技術(shù)可以有效對不同品種進行物種鑒定。劉冬芝等[38]運用RAPD 技術(shù)分析了新品種高經(jīng)濟作物大酸棗的起源和種質(zhì)資源，試驗應(yīng)用了16 對引物，為材料選取了三個類群的棗共11 種為材料，包括酸棗群、大酸棗和無核小棗等，選取的16 條引物清晰地將其分開，聚類分析后表明無核小棗與酸棗親緣關(guān)系近；大酸棗是無核小棗與酸棗的一種中間類型。葉春秀等[39]對新疆地區(qū)特有新品種哈密玉棗進行了RAPD 分析，結(jié)果表明，運用2 條引物就可以將哈密玉棗進行聚類分析，可見分子標(biāo)記技術(shù)通過聚類分析可以將棗進行物種鑒定。

3 小結(jié)

綜上所述，分子標(biāo)記在棗的遺傳圖譜構(gòu)建、分類及親緣關(guān)系、遺傳多樣性及鑒定育種方面還未得到廣泛的應(yīng)用。分子標(biāo)記技術(shù)對于棗品種鑒定、種質(zhì)資源保護、親緣關(guān)系研究等都有十分重要的意義，彌補了傳統(tǒng)分類及育種方法的不足。我國棗分子標(biāo)記下一步的研究熱點主要集中在以下四個方面：一是，對棗分子標(biāo)記反應(yīng)體系不斷優(yōu)化，高效地完成分子標(biāo)記；二是，多種分子標(biāo)記聯(lián)用，彌補單一使用的缺陷；三是，不斷改進現(xiàn)有的分子標(biāo)記方式，使棗的分子標(biāo)記技術(shù)更加簡便、成熟；四是，采用傳統(tǒng)與分子標(biāo)記結(jié)合的育種方式。相信未來隨著分子標(biāo)記技術(shù)在紅棗遺傳育種研究上的深度擴展，可以有效縮短育種年限、提高育種效率，推動紅棗遺傳育種的研究，從而促進棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。