CRMP5在胃癌細(xì)胞的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

陳立冬，張連峰

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052

胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，死亡率是腫瘤相關(guān)疾病死亡的第三位，具有發(fā)現(xiàn)晚和治療效果不佳等特點(diǎn)[1]。傳統(tǒng)的治療手段主要是手術(shù)聯(lián)合放療、化療等，但這些方法治療效果不理想且對(duì)患者傷害較大，因此，研究胃癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和凋亡的具體機(jī)制，繼而探索新的分子靶向位點(diǎn)，對(duì)提高胃癌的早期診斷準(zhǔn)確率以及中晚期胃癌的治療效果具有重要意義[2-5]。坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白家族(collapsin response mediator proteins，CRMPs)參與調(diào)控細(xì)胞的分化、凋亡[6]、神經(jīng)元突起的生長發(fā)育[7]等過程；CRMP5屬于CRMPs家族，有研究[8]發(fā)現(xiàn)CRMP5與一些腫瘤的發(fā)生存在一定關(guān)系。本研究通過檢測(cè)胃癌組織和細(xì)胞中CRMP5的表達(dá)，探討其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，以期為胃癌的預(yù)防和治療提供研究方向和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本來源收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科2015年4月至2016年5月入院的67例患者為研究對(duì)象，均經(jīng)病理確診為胃癌。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受放療、化療及免疫治療等，臨床資料完整，未合并其他嚴(yán)重的消化系統(tǒng)疾病。所有患者于手術(shù)中切除胃癌組織及正常胃黏膜組織，置于液氮中保存，術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。

1.2主要實(shí)驗(yàn)材料和試劑人胃黏膜上皮正常細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞AGS、MGC-803購自中科院上海細(xì)胞庫； DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、MTT試劑盒購自美國Sigma公司；Trizol、熒光定量PCR試劑盒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC和PI試劑盒、BCA試劑盒、PVDF、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人CRMP5、Ki-67、MMP-2和MMP-9單克隆抗體、si-CRMP5及陰性對(duì)照(si-con)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；兔抗人活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)多克隆抗體、β-actin多克隆抗體、山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)和山羊抗鼠IgG-HRP購自北京博奧森生物科技有限公司。qRT-PCR儀購自美國BIO-RAD公司，熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，流式細(xì)胞儀購自美國FACS caliber公司。

1.3胃癌及正常組織中CRMP5蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)制備組織石蠟切片，乙醇脫水處理，再用檸檬酸鹽溶液浸潤20 min，PBS清洗后加體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫溶液室溫下反應(yīng)25 min，PBS洗滌后，滴加正常山羊血清室溫封閉30 min；之后分別滴加一抗(兔抗人CRMP5抗體，按1∶500稀釋)4 ℃過夜孵育，PBS洗滌3次后滴加稀釋好的熒光二抗(IgG-HRP；按1∶1 000稀釋)，37 ℃孵育1 h。滴加DAB避光孵育5 min，蘇木精復(fù)染，中性膠封片，最后在熒光顯微鏡下觀察、采集圖像，根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例以及染色程度對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定[7]：兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)之和≤2分記為陰性；>2分記為陽性。

1.4GES-1、AGS和MGC-803細(xì)胞中CRMP5表達(dá)水平的檢測(cè)將GES-1、AGS和MGC-803細(xì)胞復(fù)蘇后，用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換一次新鮮的培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，加2.5 g/L胰蛋白酶溶液消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。選取CRMP5 mRNA和蛋白表達(dá)最高的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.1 CRMP5 mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè) 更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃延長5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。CRMP5正向引物序列：5’-TTGTG GACGCTTATGAGAAGTG-3’，反向引物序列：5’-CT CACCAGTGTCTCCATTTCTG-3’；GAPDH正向引物序列：5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，反向引物序列：5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’。上述引物均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4.2 CRMP5蛋白表達(dá)的Western blot法檢測(cè) 更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。測(cè)濃度后上樣，電泳90 min轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉90 min后加入CRMP5、β-actin抗體4 ℃孵育過夜；TBST洗膜后加入山羊抗兔IgG-HRP或山羊抗鼠 IgG-HRP室溫孵育2 h，再用TBST洗滌3次，5～10min/次，顯影，定影，用Quantity One凝膠分析軟件處理，測(cè)各條帶吸光度值。蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶吸光度值/β-actin條帶吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞分別接種于24孔板中，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組(si-con組)和CRMP5沉默組(si-CRMP5組)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。參照Lipofectamine 2000試劑盒操作說明，將終濃度為40 nmol/L的si-con或si-CRMP5轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。

1.6細(xì)胞增殖的MTT檢測(cè)將1.5中的3組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48或72 h后，加入5 g/L MTT 10 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h；1 000 r/min離心10 min，吸棄培養(yǎng)液，每孔加 150 μL的DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。然后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm波長的吸光度值。細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/空白對(duì)照吸光度值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞凋亡的雙染法檢測(cè)3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用PBS洗滌3次，2.5 g/L胰蛋白酶消化，PBS洗滌，加入Binding Buffer 200 μL重懸細(xì)胞，依次加入5 μL Annexin V-FITC和PI，充分混勻后室溫下避光孵育15 min，加入300 μL Binding Buffer，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8細(xì)胞遷移和侵襲能力的Transwell小室檢測(cè)在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，收集3組細(xì)胞，更換為無血清培養(yǎng)基，饑餓處理12 h。將Matrigel膠與無血清培養(yǎng)基混勻，加入Transwell上室。細(xì)胞調(diào)整為5×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，吸取100 μL接種于上室。下室加入含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)48 h后，用無菌棉簽除去多余細(xì)胞和Matrigel膠，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，于顯微鏡下隨機(jī)拍照，計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)目。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，Transwell上室不加入Matrigel膠，其余步驟與細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9細(xì)胞中CRMP5、Ki-67、Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)方法同1.4.2。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行分析。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析胃癌患者正常胃黏膜組織和胃癌組織中CRMP5蛋白表達(dá)的差異，應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較GES-1、AGS和MGC-803細(xì)胞中CRMP5表達(dá)的差異以及3組MGC-803細(xì)胞的增殖活力、細(xì)胞凋亡率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞中CRMP5、Ki-67、Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1正常胃黏膜組織和胃癌組織中CRMP5蛋白表達(dá)的比較人正常胃黏膜上皮組織(67例)中CRMP5表達(dá)均呈陰性，胃癌組織(67例)中CRMP5表達(dá)陰性27例，陽性40例(圖1)。陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈褐色，細(xì)胞核幾乎不著色。進(jìn)一步研究(表1)發(fā)現(xiàn)，不同年齡、性別、分化程度的胃癌組織中CRMP5的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而侵襲深度、TNM分期對(duì)CRMP5表達(dá)影響較大，T3～4及TNMⅡ～Ⅳ期胃癌組織中CRMP5蛋白陽性表達(dá)率較高(P<0.05)。

表1 不同臨床特征胃癌組織中CRMP5蛋白表達(dá)的比較例

2.2正常胃黏膜上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中CRMP5表達(dá)的比較見表2。與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1

相比，胃癌細(xì)胞AGS和MGC-803中CRMP5 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；其中，MGC-803細(xì)胞表達(dá)差異更為顯著，故選用其進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 正常胃黏膜上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中CRMP5的表達(dá)比較(n=3)

2.3沉默CRMP5對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖、凋亡的影響見圖2、表3。由表3可知，與對(duì)照組和si-con組相比，si-CRMP5組細(xì)胞的活力、細(xì)胞中CRMP5和Ki-67蛋白表達(dá)水平降低；凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。

2.4沉默CRMP5對(duì)MGC-803細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響見圖3、4和表4。由表4可知，與對(duì)照組和si-con組相比，si-CRMP5組細(xì)胞的遷移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)水平及遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲數(shù)均降低(P<0.05)。

1：對(duì)照組；2：si-con組； 3：si-CRMP5組

表3 3組MGC-803細(xì)胞的活力和細(xì)胞中CRMP5的表達(dá)及細(xì)胞增殖、凋亡的比較(n=3)

圖3 3組MGC-803細(xì)胞遷移和侵襲能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(結(jié)晶紫染色，×200)

1：對(duì)照組；2：si-con組； 3：si-CRMP5組

表4 3組MGC-803細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)及細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)的比較(n=3)

3 討論

有研究[9]報(bào)道，我國胃癌死亡占據(jù)腫瘤死亡的23.24%。目前胃癌診斷的影像學(xué)檢查和細(xì)胞學(xué)檢查存在一定的不足，導(dǎo)致較大多數(shù)胃癌患者在確診時(shí)已進(jìn)入轉(zhuǎn)移期，預(yù)后較差[10]。

CRMPs蛋白家族包括CRMP1～5五個(gè)成員，其中CRMP5是該家族最新發(fā)現(xiàn)的成員，CRMP5在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)控作用，還可參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11-12]。Moutal等[13]研究發(fā)現(xiàn)，CRMP5能通過Notch依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和存活。Zheng等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-214-5p可以通過調(diào)節(jié)CRMP5抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Wang等[15]指出，CRMP5與骨肉瘤細(xì)胞生長呈正相關(guān)，CRMP5高表達(dá)與骨肉瘤患者預(yù)后不良有關(guān)。本研究通過比較胃黏膜上皮正常組織(細(xì)胞)與胃癌組織(細(xì)胞)中CRMP5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌組織(細(xì)胞)中CRMP5的表達(dá)增加；沉默CRMP5基因后，胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖能力降低，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞侵襲和遷移能力降低。

Cleaved Caspase-3蛋白是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶[16]；Ki-67是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白，在細(xì)胞有絲分裂過程中發(fā)揮作用[17-18]；MMP-2和MMP-9可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默CRMP5后胃癌MGC-803細(xì)胞中Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平降低，Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高；提示CRMP5可能通過上調(diào)Cleaved Caspase-3和下調(diào)Ki-67、MMP-2、MMP-9抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

綜上所述，CRMP5在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，干擾其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、降低細(xì)胞侵襲和遷移能力。該研究結(jié)果為以CRMP5為靶點(diǎn)的胃癌防治提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。