miR-212-3p靶向長(zhǎng)鏈非編碼RNA SCAMP1在胃癌中的差異表達(dá) ①

戴 凌 ， 蔣志慶， 甘信利

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，廣西 桂林 541001)

胃癌(Gastric cancer， GC)是中國常見的消化道系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，目前早期的GC診斷依然困難重重，大多數(shù)的患者仍處于晚期階段才被診斷出來，且治療效果并不理想。因此鑒定新的分子生物標(biāo)志物和探索GC發(fā)病機(jī)制對(duì)于早期的診斷和治療都有著重要的意義。

非編碼RNA中的微小RNA(microRNA， miRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA， lncRNA)在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，miRNA可以與LncRNA相互調(diào)控，在腫瘤中發(fā)揮促癌基因或者抑癌基因作用[2]。已有研究證明，miR-212-3p在胃癌中低表達(dá)，其表達(dá)水平跟胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[3]。本研究通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)miR-212-3p潛在的靶向調(diào)控LncRNA；通過COX風(fēng)險(xiǎn)模型研究miR-212-3p和其靶向調(diào)控的LncRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為了解miR-212-3p和LncRNA在胃癌的預(yù)后機(jī)制中提供有價(jià)值的線索。

1 資料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

通過starBase 2.0預(yù)測(cè)miR-212-3p的靶向LncRNA，使用COX風(fēng)險(xiǎn)模型分析預(yù)測(cè)LncRNA和miR-212-3p對(duì)胃癌患者生存時(shí)間的影響。

1.2 標(biāo)本采集

選擇2016年1～3月于本院腫瘤科就診的56例胃癌患者，均排除化療、放療、使用激素患者，所有胃癌患者均經(jīng)病理檢查確診為胃癌患者。每例標(biāo)本取腫瘤組織及對(duì)應(yīng)的距腫瘤5 cm以上的癌旁正常胃黏膜組織(簡(jiǎn)稱遠(yuǎn)癌組織)。樣品置于-80 ℃保存。

1.3 Real-time PCR檢測(cè)miR-212-3p、SCAMP1的表達(dá)

將取得新鮮的胃癌組織及遠(yuǎn)癌組織液氮研磨，參照Trizol試劑盒說明書提取組織中的總RNA，使用NanoDrop 2000c測(cè)定 RNA的純度和濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄總RNA至cDNA，反應(yīng)條件為16 ℃、30 min，42 ℃、40 min，85 ℃、5 min。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行SYBR-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；40個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃，10 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s)，miR-212-3p以U6為內(nèi)參，SCAMP1以GAPDH為內(nèi)參。引物交由上海生工設(shè)計(jì)合成，數(shù)據(jù)采用2-△△ct法進(jìn)行分析。詳見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

通過starBase 2.0預(yù)測(cè)miR-212-3p靶向SCAPM1等21個(gè)LncRNA。詳見圖1。

將miR-212-3p和預(yù)測(cè)到的21個(gè)LncRNA進(jìn)行COX回歸分析，結(jié)果顯示miR-212-3p風(fēng)險(xiǎn)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.97)，SCAMP1風(fēng)險(xiǎn)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(RR=1.19，P=0.034)。詳見表2。

采用TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行SCAMP1表達(dá)的胃癌患者生存分析，結(jié)果顯示：SCAMP1低表達(dá)患者中位生存時(shí)間(921±21)d，明顯高于SCAMP1高表達(dá)患者中位生存時(shí)間(615±11)d，(P=0.0031)。詳見圖2。

圖1 miR-212-3p靶向LncRNA的交互作用圖

表2 miR-212-3p和SCAMP1的COX回歸模型參數(shù)估計(jì)表

圖2 SCAMP1在250例胃癌患者生存曲線圖

2.2 Real-Time PCR 驗(yàn)證結(jié)果

56例胃癌患者，男43名，女13名；平均年齡(47.23±5.26)歲。Real-Time PCR結(jié)果顯示：miR-212-3p在胃癌組織中低表達(dá)， SCAMP1在胃癌組織中高表達(dá)(P<0.05)。詳見圖3，圖4。

與遠(yuǎn)癌組織比較，* P<0.05圖3 miR-212-3p 在胃癌組織和遠(yuǎn)癌組織中相對(duì)表達(dá)

與遠(yuǎn)癌組織比較，* P<0.05圖4 SCAMP1在胃癌組織和遠(yuǎn)癌組織中相對(duì)表達(dá)

3 討論

miRNA、LncRNA屬于高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，并廣泛存在于真核生物中[4]。正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)miRNA、LncRNA表達(dá)遵守嚴(yán)格的組織、時(shí)序特異性[5]。但在腫瘤環(huán)境下，不同miRNA、LncRNA則表現(xiàn)出不同的生物學(xué)活性[6]，并起到類似促癌基因或抑癌基因的作用。

在競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)假說中，闡述了mRNA、lncRNA和miRNA之間的作用：lncRNA中含有與miRNA反應(yīng)類似的元件，進(jìn)而可作為ceRNA與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，共同對(duì)編碼基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[7]。Yang等[8]研究顯示LINC00703作為miR-181a的ceRNA，可以在胃癌細(xì)胞中上調(diào)KLF6表達(dá)來發(fā)揮抑癌作用。Shi等[9]發(fā)現(xiàn)LncRNA PAPAS在胃癌中表達(dá)上調(diào)，并與胃癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān)。PAPAS通過負(fù)調(diào)控miR-188-5p水平加重胃癌的進(jìn)展。lncRNA SNHG8通過靶向miR-491/PDGFRA軸促進(jìn)了GC細(xì)胞的增殖和侵襲[10]。

蔣佩佩[11]研究表明胃癌組織中 miR-212-3p與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，提示miR-212-3p在胃癌的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮著抑癌基因的功能， Wada等[12]通過miRNA芯片方法分析胃癌組織和正常胃組織，發(fā)現(xiàn) miR-212-3p可能通過下調(diào)MECP2，與胃癌的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。Ma[13]等研究表明miR-212-3p在胰腺癌中高表達(dá)，且高表達(dá) miR-212-3p促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲；miR-212-3p在急性髓系白血病高表達(dá)，能促進(jìn)患者預(yù)后[14]。趙健麗[15]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-212-3p后，細(xì)胞克隆形成能力減弱、細(xì)胞周期 G1/S 進(jìn)程阻滯，而且細(xì)胞的遷移和侵襲能力也減弱，并抑制上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的進(jìn)程，miR-212-3p通過靶向SMAD2發(fā)揮抑癌作用。這表明miR-212-3p在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。

本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-212-3p靶向的LncRNA，包括SCAMP1在內(nèi)的21個(gè)LncRNA。運(yùn)用COX風(fēng)險(xiǎn)模型分析，結(jié)果顯示SCAMP1在胃癌中風(fēng)險(xiǎn)比為1.19，miR-212-3p風(fēng)險(xiǎn)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示miR-212-3p可能通過靶向SCAMP1與胃癌患者的預(yù)后有關(guān)。生存分析顯示，低表達(dá)的SCAMP1可以顯著性增加患者生存時(shí)間，說明SCAMP1可能在胃癌中起促癌作用。

本研究預(yù)測(cè)并驗(yàn)證胃癌組織中高表達(dá)的LncRNA-SCAMP1，是胃癌中首次報(bào)道的差異LncRNA。后期需要FISH技術(shù)對(duì)SCAMP1在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行共定位，分別對(duì)SCAMP1及miR-212-3p進(jìn)行干擾及過表達(dá)，對(duì)凋亡相關(guān)靶向基因進(jìn)行更深入的研究。