環狀RNA在乳腺癌中的研究進展

劉晶晶，周冬冬，張瑾

環狀RNA（circular RNAs,circRNAs）于1976年通過電子顯微鏡在RNA病毒中首次被發現。隨后，在真核生物中也清晰地觀察到了circRNA的結構［1］。與線性RNA結構不同，circRNA是單鏈共價閉合環狀結構，無5'帽端和3'尾端［2］。在過去的30年里，這些circRNA被認為是錯誤剪接或前體mRNA加工過程中的副產物。在不同的生物體中，也只有少量circRNA被發現［3］。然而，隨著高通量測序技術的發展和廣泛應用，以及針對circRNA檢測和量化的特定方法的發展，circRNA作為一種新興的非編碼RNA被推到了聚光燈下，大量circRNA已被成功識別。研究表明circRNA廣泛參與了細胞的生長、分化、發育和凋亡在內的病理生理過程，并與多種惡性腫瘤的發生、進展相關［4］。這為我們提供了腫瘤研究的新方向。

1 circRNA概述

1.1 circRNA分類及其形成機制 circRNA是一類不具有5'末端帽結構和3'末端polyA尾結構，并以共價鍵的形式形成環形結構的特殊RNA分子。具體來說，環狀是借助套索結構或內含子的互補配對，以反向剪切的方式來形成的［5］。根據circRNA的來源可分為3類：外顯子 circRNA（exonic circRNA，ecRNA）、內含子 circRNA（intronic circRNA，ciRNA）以及由外顯子和內含子共同組成的circRNA（exonintron circular RNAs，EIciRNA）［6-7］。circRNA的產生機制較為復雜，主要有套索驅動的環化、內含子配對驅動的環化形成的外顯子circRNA，內含子獨立環化、內含子RNA結合蛋白（RNA binding protein，RBP）或轉錄因子驅動的環化形成的內含子circRNA等機制［8］。目前circRNA的產生機制仍在不斷探索中。

1.2 circRNA的特性

1.2.1 保守性 大多數circRNA中的一些序列在進化上是保守的。作為非編碼RNA的一種，circRNA保留了相似的RNA結構。circRNA主要特點是以1個2'，5'-磷酸二酯鍵使首尾相連，而競爭性內源RNA（Competing endogenous RNA，ceRNA）則以1個3'，5'-磷酸二酯鍵連接首尾兩端。這種特殊的反式剪接具有高度的保守性［9］。circRNA的保守核苷酸序列豐度明顯增加。通過自身的miRNA應答元件（MicroRNA response element，MRE）競爭性結合同一miRNA，與其他具有MRE的ceRNA［假基因轉錄本、長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）和mRNA等］相比，circRNA因其特殊結構而具有的穩定性使其成為一種優勢ceRNA［10］。

1.2.2 穩定性 多數circRNA可以在細胞質中穩定存在。這種穩定性可能是由于circRNA缺乏與mRNA類似的5'帽和3'尾端結構，從而避免了脫腺苷化、脫帽等降解反應［11］。

1.2.3 豐富性 circRNA在生物體中廣泛存在和表達，也存在于人體多種體液中，如血漿［12］、唾液［13］以及外泌體等［14］。

1.2.4 特異性 不同細胞、組織在不同發育階段具有circRNA特異表達譜，這種表達的特異性提示不同的circRNA具有特定功能。

1.3 circRNA的生物學功能 雖然關于circRNA參與調控生物學功能的機制尚不清楚，但越來越多的證據表明其參與了一系列的病理生理過程。

1.3.1 miRNA海綿樣作用 CircRNA含有大量不同類型的miRNA反應元件，可以與miRNA相互作用，在細胞中充當miRNA海綿、消除miRNA對其靶基因的抑制作用，這種抑制能力稱為miRNA海綿作用。CDR1as，即ciRS-7，包含70多個保守的結合位點，在人類和小鼠的大腦中高度表達，首次報道其功能即是作為miR-7的海綿發揮作用［9］。另外一種circRNA——Sry（sex-determining region Y）被報道可作為miR-138的海綿，從而調控腫瘤細胞的侵襲和轉移［15］。以上研究結果表明，circRNA可以作為miRNA海綿參與腫瘤的調控。

1.3.2 circRNA與蛋白結合 CircRNA可以直接或通過RNA與蛋白質分子特異性結合，也可以作為競爭分子阻斷蛋白質與靶分子的結合［16］。circRNA與蛋白質相互作用的一個例子是circFoxo3。CircFoxo3優先在細胞質中表達，可以與抗衰老蛋白質分化抑制因子1（Inhibitor of differentiation-1，ID1）、轉錄因子E2F1（E2F1基因編碼的、與細胞周期相關的轉錄因子）和抗應激蛋白局部黏著斑激酶（Focal adhesion kinase，FAK）/HIF1α結合，導致結合體滯留在細胞質中，阻止ID1 E2F1-FAK/HIF1α的核易位，從而抑制心肌細胞的抗衰老和抗應激功能［17］。

1.3.3 circRNA調控基因轉錄 雖然大多數circRNA作為miRNA海綿調控miRNA，但也有一些circRNA可以順式或反式調控基因轉錄。研究發現，細胞核內的circRNA被敲除后，其對microRNA靶點的富集減少，這也導致了它們的親本基因表達減少；例如ci-ankrd52和ci-sirt7通過與PolⅡ相互作用，可以作為親本基因轉錄的正向調控因子，這說明內含子circRNA可以調控親本基因的轉錄［6］。

1.3.4 circRNA參與蛋白質的翻譯 大多數研究人員認為circRNA是一類獨特的內源性非編碼RNA，不能翻譯蛋白質。然而，考慮到大多數circRNA是由編碼基因產生的，并且包含完整的外顯子，一些circRNA被證明有潛力被翻譯成蛋白質。研究人員在大腸桿菌中轉染插入了綠色熒光蛋白開放閱讀框的人工circRNA，可以使大腸桿菌產生極長的蛋白鏈［18］。此外，Legnini等［19］研究發現，circ-ZNF609可以翻譯小鼠成肌細胞中的蛋白。總之，目前已有證據證明circRNA可以直接翻譯蛋白質。

2 circRNA在乳腺癌中的研究進展

早期研究表明，circRNA在許多癌組織中均有差異表達，隨著高通量測序技術的發展，包括乳腺癌在內的腫瘤組織中已發現大量circRNA，提示circRNA可能被應用于乳腺癌的診斷和治療。

2.1 circRNA在乳腺癌中的表達 越來越多的證據表明，在正常乳腺組織中檢測到的circRNA數量高于腫瘤組織。在最近的一項研究中，研究人員篩選了乳腺癌和鄰近正常組織中的circRNA表達譜，circRNA微陣列分析結果顯示，1 155個差異表達circRNA中715個上調，440個下調，證明了hsa_circ_103110、hsa_circ_104689和hsa_circ_104821水平在乳腺癌組織中升高，而hsa_circ_006054、hsa_circ_100219和hsa_circ_406697水平在乳腺癌組織中降低［20］。Nair等［21］開發了Circ-Seq工作流程，以識別乳腺腫瘤樣本特異性的circRNA，并編制3種乳腺癌亞型中獨特的circRNA：三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）、雌激素受體陽性（ER+）和ErbB2過表達HER2陽性（HER2+）乳腺癌；值得注意的是，與來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的鄰近正常乳腺組織以及來自基因型組織（GTEx）的正常乳腺組織樣品相比，在乳腺腫瘤中觀察到較少數量的circRNA表達；此外，此項研究還發現ER+乳腺癌癌旁正常組織中的circRNA與增殖基因的復發風險增殖（ROR-P）評分呈負相關，提示circRNA可能是乳腺癌和相關細胞增殖的標志物。

2.2 circRNA與乳腺癌的增殖和進展

2.2.1 circRNA通過microRNA海綿調節乳腺癌的增殖和進展 越來越多的證據證明，microRNA在腫瘤發生過程中調控基因表達。深入研究發現，部分circRNA作為microRNA海綿參與調控腫瘤的增殖、轉移和侵襲。Tang等［22］研究發現circRNA hsa_circ_0001982在乳腺癌組織和細胞系中明顯過表達，其通過靶向miR-143發揮競爭性內源性RNA（ceRNA）的作用；敲低hsa_circ_0001982可以抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲，并誘導細胞凋亡。該研究探討了circRNA的ceRNA機制在乳腺癌發生發展中的作用，為基礎研究提供了新的視角。

有研究報道，circGFRA1在乳腺癌中上調表達，并與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移和組織學分級呈正相關；進一步的實驗表明，circGFRA1可能作為miR-34a海綿通過ceRNA機制起到調節GFRA1表達的作用，從而促進細胞增殖，抑制TNBC的凋亡［23］。上述研究證明circRNA可通過miRNA海綿作用隔離與增殖相關的特定miRNA，從而調節腫瘤的發生、發展。

2.2.2 circRNA通過癌癥相關的信號通路調節乳腺癌細胞的增殖和進展 乳腺癌細胞增殖與多種癌癥相關信號通路的異常激活有關。研究表明，circRNA通過直接調控靶基因或與癌癥相關信號通路密切相關的miRNA相互作用，在乳腺癌的發生、增殖、轉移和侵襲過程中發揮重要作用。最近一項研究表明，hsa_circ_0011946/復 制 因 子 C3（Replication factor，RFC3）信號通路的失活可能抑制MCF-7細胞的遷移和侵襲能力［24］。miR-7作為一種抑癌miRNA，在乳腺癌組織中的表達低于正常乳腺組織，在侵襲性乳腺癌細胞系中過表達miR-7可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲［25］。目前，miR-7已被證實可通過直接下調表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）［26］、紅系 Kruppel樣因子（Kruppel like factor，KLF4）［27］、組蛋白甲基轉移酶 SETDB1［28］等關鍵促癌因子的表達參與許多癌癥相關的信號通路，這些研究表明miR-7具有明顯的抑癌作用。Zhang等［28］證明miR-7通過直接抑制致癌基因SETDB1的表達，從而阻斷STAT3信號通路，進而抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲，部分逆轉MDA-MB-231乳腺癌細胞的上皮-間充質轉化（Epithelialmesenchymal transition，EMT）；該研究還發現ciRS-7可能作為miR-7的競爭性circRNA減弱miR-7對STAT3通路的抑制。綜上所述，新發現的ciRS-7作為一種抑制miR-7的circRNA，參與了許多癌癥相關的信號通路。

2.3 circRNA與乳腺癌的診斷與預后 預后評估對預后不良因素的早期干預和癌癥患者預期壽命的延長具有重要意義。近年來研究表明，circRNA參與了乳腺癌的多種病理過程。探索circRNA作為乳腺癌診斷和預后的生物標志物具有重要臨床意義和價值。例如，乳腺癌患者術后血漿hsa_circ_0001785水平較術前明顯降低，提示其可作為判斷預后的生物標志物［29］。這種現象可能主要是由于乳腺癌切除后腫瘤源性核酸的釋放減少引起的［30］。而且血漿中hsa_circ_0001785的水平還與乳腺癌的組織學分級、TNM分期及遠處轉移密切相關，從而利用has-circ-0001785在不同分期乳腺癌組織中表達水平的差異進一步對乳腺癌進行細化分期分級。此外，有報道稱circGFRA1在乳腺癌組織中上調，與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移和TNBC的組織學分級呈正相關［23］。以上研究證明circRNA在乳腺癌的診斷和預后方面具有較好的應用前景。

2.4 circRNA與乳腺癌化療耐藥的關系 circRNA不僅與乳腺癌的發生和發展有關，而且與乳腺癌化療的不良反應及耐藥產生也有著密切的聯系。化療是治療乳腺癌的有效臨床策略，但有時因為藥物耐藥導致療效降低，從而導致乳腺癌患者治療失敗和較差的預后。探索化療耐藥產生機制中涉及的分子途徑至關重要。例如，Gao等［31］在阿霉素耐藥的MCF-7乳腺癌細胞系和其親代細胞中篩選出了18個差異表達的circRNA，其中hsa_circ_00006528在阿霉素耐藥細胞中的表達相對阿霉素敏感細胞系更高；此外，還進一步揭示了hsa_circ_00006528-miR-7-5p-Raf1反應軸在乳腺癌耐藥相關機制中的作用，揭示了hsa_circ_00006528克服阿霉素耐藥性的可能性。此外，Miao等［32］證明了 miR-130b 靶向PTEN通過PI3K/Akt信號通路誘導多藥耐藥；考慮到circRNA的生物學功能，某些circRNA可能充當miR-130b的海綿，與PI3K/Akt信號通路中相關靶基因作用參與乳腺癌的化療耐藥。鑒于circRNA與乳腺癌耐藥的關系，分析circRNA的異常表達對于乳腺癌的進一步治療至關重要。

2.5 circRNA與乳腺癌的靶向治療 CircRNA具有潛在的抗癌作用，目前已有大量的circRNA被證實與乳腺癌的增殖和進展有關，顯示了其作為乳腺癌治療靶點的潛在作用。Wang等［33］研究表明，circRNA-000911在乳腺癌中通過對miR-449的海綿樣作用，從而激活Notch1和核因子（NF）-κB信號通路，發揮其抑制腫瘤的作用。因此，circRNA-000911可能為乳腺癌的新治療策略的制定提供了一個新的方向。此外，研究報道circ-Foxo3可誘導腫瘤細胞凋亡和抑制乳腺癌進展，因此其有望成為一種新的乳腺癌治療靶點［34］。目前，研究表明腫瘤干細胞對腫瘤的存活、增殖、轉移及復發有著重要作用［35］。傳統治療方法最終失敗的原因可以歸結為沒有殺死腫瘤干細胞，最終導致腫瘤復發。為了預防乳腺癌的復發和轉移，根除乳腺癌干細胞（breast cancer stem cells BCSCs）至關重要。Yan 等［36］使用RNA測序技術篩選了BCSCs中的circRNA譜，發現27個circRNA表達異常，其中19個表達下調，8個表達上調，并且發現circVRK1可以抑制乳腺癌干細胞的擴張和自我更新能力。此項研究結果表明circVRK1可能是乳腺癌的一個治療靶點。

目前，有幾種技術為部分或完全去除致癌circRNA提供了前所未有的機會，包括基于siRNA的治療［37］、反義寡核苷酸治療［38］、CRISPER/Cas系統［39］等。相反，以往的研究表明，參與癌癥的miRNA可以分為促癌miRNA和抑癌miRNA。前者可以通過miRNA海綿的功能或其他途徑被circRNA所抑制。由于某些circRNA對特定的miRNA具有許多結合位點，因此它們比典型的miRNA抑制劑更有效。此外。有研究表明，細胞外囊泡很有可能可以有效地將circRNA傳遞到準確的作用位點［40］。

3 展望

circRNA曾被認為是mRNA錯誤剪接形成的副產物，現在被認為是RNA領域中一個新興的關鍵分子。circRNA分子具有miRNA海綿樣作用、調控轉錄和翻譯、作為生物標志物以及抑癌因子等一系列功能，被認為是各種生理和病理生理過程中的重要調控因子。近年來，諸多研究探索了circRNA在癌癥中的臨床價值。本文介紹了circRNA參與乳腺癌的增殖、遷移、侵襲和凋亡等多種生物學過程，其作為在乳腺癌診斷、預后、復發和風險評估等方面有前景的生物標志物，是潛在的治療靶點。總之，circRNA為乳腺癌的診斷和治療提供了一個新的視角。然而，與編碼RNA、miRNA和lncRNA相比，目前我們對circRNA的認識還比較淺顯，大多數circRNA的生理和病理過程中的生物學功能還需要進一步的研究來揭示，以便在未來應用于臨床。