高敏HBV DNA及HBsAg定量對低病毒載量慢性乙型肝炎的臨床價值

張小曼 何彩婷 張純瑜 許正鋸

近年來，國內外各版CHB防治指南均推薦采用HBV DNA檢測下限(10～12 IU/mL)判斷治療終點[1-5]。但目前多數檢測方法的下限仍為HBV DNA<500 IU/mL，已不能滿足臨床診療需求。本研究利用高敏HBV DNA檢測技術，檢測下限為20 IU/mL，同時結合HBsAg定量、HBeAg、ALT、GP73等指標分析其與高敏HBV DNA的關聯性，以期進一步探討高敏HBV DNA的臨床應用價值，為臨床診療提供幫助。

資料與方法

一、臨床資料

收集2018年4月至2019年10月就診于解放軍聯勤保障部隊第910醫院肝病中心CHB患者654例。其中男性525例，女性129例，年齡為40(8～82)歲，以30～49歲患者為主，占61.31%(401/654)。對其中的427例高敏HBV DNA<500 IU/mL的患者抗病毒治療史進行了隨訪：分為未治療(49例)、≤1年(78例)、1～2年(58例)、2～3年(75例)、>3年(167例)。納入病例的診斷標準均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[1]。排除酒精性肝病、脂肪肝、自身免疫性肝病、其他嗜肝病毒及環境因素引起的肝功能損傷患者。標本均為新鮮分離血清，-80 ℃保存、整批待檢。所有患者均簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會批準。

二、研究方法

HBsAg、HBeAg采用羅氏e601全自動電化學發光分析儀檢測； GP73測定，按照北京熱景生物技術公司提供的GP73酶聯免疫定量檢測試劑盒說明書操作，酶標儀采用美國Biorad-860檢測GP73反應板吸光度；ALT測定采用美國貝克曼(Beckman Coulter)AU680全自動生化分析儀；高敏HBV DNA定量采用湖南圣湘生物科技有限公司提供的乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒，采用Natch S全自動核酸提取儀(湖南圣湘生物科技有限公司)提取血清HBV DNA，采用SLAN-96P PCR擴增儀(上海宏石醫療科技有限公司)進行實時熒光定量檢測。

三、統計學方法

采用SPSS 17.0、MedCalc 15.6軟件進行統計分析。HBsAg呈偏態分布，采用中位數(四分位間距)表示，其他指標采用分類計數頻數統計。HBsAg組間比較采用多個獨立樣本的秩和檢驗(Kruskal Wall Test)；分類計數資料組間比較采用Pearson卡方檢驗；臨床指標與高敏HBV DNA相關性采用曲線估計(Curve Estimation)方法中的曲線相關擬合方式，選取相關系數較大的擬合曲線作為相關模型，并進行F檢驗；臨床指標與治療時間趨勢相關性采用Cochram Armitage趨勢檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、不同HBV DNA載量的CHB患者臨床指標比較

ALT、GP73異常率、HBeAg陽性率及HBsAg含量在不同HBV DNA載量水平間均差異有統計學意義(均P<0.01)，如表1所示。

二、臨床指標與陽性高敏HBV DNA相關性

654例CHB患者中，高敏HBV DNA陽性的有402例，HBsAg和高敏HBV DNA同時陽性的有401例，各臨床指標與陽性高敏HBV DNA的相關關系如下：ALT與陽性高敏HBV DNA存在冪函數相關性，相關系數為0.394，差異有統計學意義(F=73.693，P<0.01)；GP73與陽性高敏HBV DNA存在Logistic相關關系，相關系數為0.369，差異有統計學意義(F=51.230，P<0.01)；HBsAg與陽性高敏HBV DNA存在拋物線函數相關關系，相關系數為0.415，差異有統計學意義(F=45.183，P<0. 01)。

表1 不同HBV DNA載量CHB患者臨床指標比較[例數(%)]

三、低載量HBV DNA的CHB患者肝功能異常情況

將427例HBV DNA<500 IU/mL HBV感染者分為高敏陰性組(<20 IU/mL)和高敏陽性組(20～499 IU/mL)。根據HBeAg狀態進一步分析患者功能損害情況，如表2所示。HBeAg(+)組中，高敏陰性與高敏陽性組ALT、GP73異常率差異均無統計學意義(χ2=1.440、0.371，均P>0.05)。但在HBeAg(-)組中，高敏陽性患者ALT異常率高于高敏陰性組，差異均有統計學意義(χ2=7.174，P=0.007)，但GP73異常率在兩組間差異無統計學意義(χ2=3.467，P=0.063)。

四、治療時間與高敏HBV DNA<500 IU/mL患者HBV DNA陽性率及臨床指標相關性

427例HBV DNA<500 IU/mL患者按治療時間分為未治療、治療1年內、治療1～2年、治療2～3年、治療大于3年，其高敏HBV DNA陽性率分別為46.94%、44.87%、24.14%、34.67%、25.75%。采用Cochram Armitage趨勢檢驗判斷治療時間與高敏HBV DNA及臨床指標間是否存在線性趨勢，結果顯示高敏HBV DNA、ALT異常率與治療時間均存在顯著負相關(χ2=10.723、13.021，均P<0.01)；GP73異常率、HBeAg 陽性率與治療時間無相關性(χ2=6.494、0.814，均P>0.05)。見表3。

采用Pearson卡方檢驗，未治療組ALT異常率與治療時間為1～2年、2～3年、大于3年均差異有統計學意義(χ2=5.138、6.918、11.730，P=0.023、0.009、0.001)。另外，隨著治療時間延長，ALT異常患者中HBV DNA陽性率分別為69.56%(16/23)、42.31%(11/26)、35.71%(5/14)、29.41%(5/17)、31.43%(11/35)。采用Pearson卡方檢驗，5組差異有統計學意義(χ2=10.128，P=0.038)。兩兩比較后發現未治療組ALT異常患者中HBV DNA陽性率與2～3年、>3年組差異有統計學意義(χ2=4.812、6.653，P=0.028、0.010)。

表2 427例高敏HBV DNA<500 IU/mL患者HBeAg狀態與臨床指標異常率分析[例數(%)]

表3 427例HBV DNA<500 IU/mL患者治療時間與臨床指標異常率分析[例數(%)]

討 論

ALT是反映肝細胞早期損傷敏感的指標[6-7]，GP73近來被認為與慢性HBV感染者肝臟炎癥損傷關系密切[8-11]。大多學者認為，病毒的持續復制會伴隨肝細胞損傷，從而引起ALT、GP73等水平升高[12-15]。但也有學者認為，ALT、GP73水平升高與HBV活躍復制無關[8]。以上這些研究者的報道大多采用的是傳統的HBV DNA檢測，忽略了病毒在低復制程度時的表達差異。本文中，ALT、GP73異常率在不同HBV DNA病毒量分組中并未隨病毒量升高而升高。在>2 000 IU/mL組，ALT、GP73異常率均為最高，但在病毒中低程度復制時，ALT、GP73異常率差異均不顯著。而相關性分析表明，ALT、GP73含量與陽性高敏HBV DNA病毒量均呈顯著曲線相關。提示ALT、GP73雖然與HBV DNA病毒量存在一定的關聯性，但在病毒高水平復制時，引起的ALT、GP73異常表達才較為明顯。在病毒復制程度較低時，ALT、GP73水平的異常升高不能準確反映患者體內病毒復制水平。

傳統認為HBsAg(+)、HBeAg(+)提示HBV復制活躍、傳染性強，而HBsAg、HBeAg轉陰，抗-HBs、抗-HBe出現是機體清除病毒的標志[16]。近年來，將HBsAg水平定量作為CHB患者抗病毒療效監測指標引起越來越多學者的關注[17-19]。本文中，HBeAg陽性率、HBsAg含量隨HBV DNA病毒量升高而升高，但在病毒低水平復制時，HBeAg陽性率無差異，HBsAg定量卻相反。另外，HBsAg含量與HBV DNA病毒量的相關性與其他臨床指標相比最好。這些結果提示，無論是在病毒高水平復制時，還是低水平復制時，HBsAg水平的變化與HBV DNA水平均有較好的關聯性。值得注意的是，252例HBV DNA<20 IU/mL的患者中，242例HBsAg陽性。這表明，HBsAg的清除與HBV DNA消失并不平行。將HBsAg定量結合高靈敏度HBV DNA檢測才能更好地評估患者病毒復制狀態及抗病毒療效。

目前國內HBV DNA定量檢測下限多為<500 IU/mL，但很多患者體內的病毒復制仍在持續，由此引起的肝損傷也常被忽略。本研究中，HBV DNA<500 IU/mL患者高敏HBV DNA陽性的占40.98%，且這部分陽性HBV DNA患者的ALT陽性率顯著高于<20 IU/mL患者，但在HBeAg陽性時，這種差異不明顯。金速速等[20]報道，HBeAg陽性和陰性組HBV DNA病毒量為30～500 IU/mL患者ALT異常率均高于<30 IU/mL患者。而李敏偉[21]認為，不同HBV DNA組內HBeAg陽性和陰性組間ALT異常率無差異，這些不同觀點可能源于標本來源的差異性。但需要注意的是HBeAg陰性并不總意味著病毒復制減弱或消失，多數HBeAg陰性CHB患者HBV DNA復制水平減弱在103～104IU/mL，少數患者體內仍在進行不同程度的病毒復制[22]。而HBeAg陰性時病毒復制水平的加強由此引發的肝損傷可能與免疫逃逸相關：HBV迫于機體的免疫壓力發生免疫突變，從而產生免疫逃避。這使肝細胞HBcAg表達增強，激發了T細胞對HBV的免疫反應引起病理損害，致使ALT表達升高[23]。

HBV DNA<500 IU/mL患者的抗病毒治療由于定量檢測方法所限也常被忽略，針對<500 IU/mL患者，未治療組ALT異常率顯著高于有經過抗病毒治療的各組別，且未治療組ALT異常患者中HBV DNA陽性率為69.56%。未治療患者體內病毒持續低水平復制可能是引起肝功能炎癥損傷的主因。隨著治療時間延長，傳統PCR法檢測下限患者的HBV DNA陽性率、ALT異常率與治療時間均存在顯著負性趨勢相關，另外，ALT異常率在治療時間大于1年后的各分組中均顯著低于未治療組，且治療時間2～3年、>3年組ALT異常患者中的HBV DNA陽性率也低于未治療組。這些結果提示，通過抗病毒治療，由于病毒持續低水平復制引起的患者肝臟炎癥損傷狀態相比未治療組得到了顯著改善。

綜上所述，ALT、GP73、HBeAg雖然能在一定程度上反映HBV復制程度，但在病毒低水平復制時(<2 000 IU/mL)，ALT、GP73、HBeAg的評估價值均不理想。相對的，HBsAg與HBV DNA病毒量有較好的關聯性，但由于HBsAg的清除與HBV DNA復制減弱有時候并不平行，將HBsAg含量與高靈敏度HBV DNA檢測值相結合，才能更好評估患者的抗病毒治療效果。另外，針對HBVDNA<500 IU/mL者，持續監測患者高敏HBV DNA，對于降低患者肝損傷，延緩疾病進展有重要意義。