肝纖維化形成與消退過程中氧化應激與ERK信號通路變化特點

平大冰 崔紅艷 孫鑫 黃愷 彭淵 陶艷艷 劉成海

肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要細胞學基礎，其活化與許多途徑和介質(zhì)密切相關，包括自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、氧化應激反應等[1]。有研究證實，過量的活性氧(reactive oxygen，ROS)激活HSC誘發(fā)纖維化形成，氧化應激同時可以激活ERK通路，參與MAPK信號通路的傳導，促進HSC的增殖和活化[2-4]。本研究采用二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)誘導肝纖維化大鼠模型，觀察肝纖維化發(fā)展與消退過程中過氧化損傷、ERK及HSC活化關系，探討氧化損傷通過ERK信號通路誘導肝纖維化的可能病理機制。

資料與方法

一、實驗動物

Wistar清潔級雄性大鼠74只，體質(zhì)量為(150±10)g，由中國科學院上海實驗動物中心提供。模型制備參照文獻[5]，以10 μL/kg劑量予大鼠腹腔注射DMN，每天1次，每周3 d，持續(xù)造模4周，分別在染毒后1 d、3 d、1周、2周、3周、4周末，與染毒停止后1周、2周、4周，共9個時間觀察點處死模型大鼠。另設正常對照組大鼠10只，按相同劑量腹腔注射0.9% NaCl溶液。

二、試劑與抗體

DMN，羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)標準品購自日本東京化成工業(yè)株式會社；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽S轉移酶(GST)試劑盒均購自中國南京建成生物有限公司；明膠購自美國Amresco公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；反轉錄及PCR擴增試劑盒為日本Takara公司產(chǎn)品。小鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體購自美國Sigma公司；小鼠抗大鼠單克隆磷酸化ERK抗體、多克隆兔抗大鼠ERK1抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；小鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2單克隆抗體購自美國Antibody Diagnostica公司；小鼠抗人MMP-9單克隆抗體、小鼠抗人組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-1單克隆抗體、小鼠抗人TIMP-2單克隆抗體均為美國NeoMarker公司產(chǎn)品。辣根過氧化物酶標記驢抗兔抗體和辣根過氧化物酶標記驢抗鼠抗體購自美國Amersham Pharmacia Biotech公司。

三、實驗方法

(一)肝組織總RNA提取與mRNA表達 Trizol抽提肝組織RNA，然后將總RNA反轉錄為cDNA，熒光定量PCR儀進行cDNA擴增，以β-actin作為內(nèi)參照基因。每個樣本設置3個副管。引物由上海生工公司合成、純化與鑒定，引物序列見表1。

(二)免疫組化染色觀察α-SMA表達變化 大鼠肝組織切片脫蠟，0.3%H2O2孵育滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，檸檬酸鹽緩沖液煮沸法抗原熱修復，5%BSA封閉，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育，DAB顯色，Image Pro Plus軟件進行半定量分析。

(三)明膠酶圖法觀察肝組織MMP-2、MMP-9活性 參考文獻[6]的檢測方法，肝組織100 mg勻漿裂解蛋白后定量，8%SDS-PAGE(含0.1%明膠)還原但非變性電泳，洗脫漂洗后，將凝膠置于孵育液中37 ℃孵育18～20 h，經(jīng)考馬斯亮藍染色，可顯示出MMP-2和MMP-9及活化的MMP-2位于藍色背景下的透亮帶。

表1 Collagen I mRNA擴增引物序列

(四)蛋白免疫印跡法檢測肝組織α-SMA、MMP2/9、TIMP1/2、ERK/p-ERK蛋白表達 肝組織100 mg裂解蛋白后定量，10%SDS-PAGE凝膠上電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜中，5%BSA封閉，4℃一抗(濃度均為1：200)孵育過夜，PBS緩沖液洗膜后將膜與相應熒光標記二抗室溫孵育1 h后用Li-Cor奧德賽成像儀進行掃描拍照，每個實驗重復3批不同樣本。

(五)肝組織脂質(zhì)過氧化測定 SOD、GST活性；GSH含量，按照試劑盒說明書步驟測定。

四、統(tǒng)計方法

結 果

一、模型大鼠肝組織膠原沉積變化

天狼猩紅染色結果顯示，染毒2周膠原纖維沉積，出現(xiàn)菲薄的纖維間隔，4周末時膠原纖維沉積明顯，纖維間隔與假小葉形成，肝組織出現(xiàn)纖維化。停止染毒后肝臟膠原沉積減輕，肝纖維化有所消退，但直至8周末時仍可見輕微纖維間隔。染毒開始后，模型大鼠肝組織Hyp含量持續(xù)升高，染毒4周時含量為正常組的1.5倍，停止染毒后，Hyp含量開始下降，8周時仍高于正常水平(見圖1，表2)。

二、模型大鼠肝組織α-SMA蛋白表達變化

免疫組化染色觀察到正常大鼠肝組織α-SMA蛋白少量表達，散見于匯管區(qū)血管壁，肝小葉內(nèi)未見陽性灶。隨DMN染毒開始，α-SMA表達增加，主要見于肝竇壁和纖維間隔處。停止染毒后，α-SMA表達下降，但仍高于正常肝組織(見圖2，表2)。

三、模型大鼠肝組織MMP-2和MMP-9活性變化

正常組大鼠MMP-2活性較弱。肝纖維化形成過程中MMP-2活性逐漸升高；停止染毒后，MMP-2活性逐漸減弱，8周時基本恢復至正常水平。正常組MMP-9活性極低，在DMN造模過程中MMP-9變化趨勢與MMP-2相似(見圖3，表2)。

注：A 正常組；B 模型組1周；C 模型組2周；D 模型組4周；E模型組6周；F模型組8周

注：A 正常組；B 模型組1周；C 模型組2周；D 模型組4周；E模型組6周；F模型組8周

圖3 大鼠肝組織MMP-2和MMP-9活性動態(tài)變化

四、模型大鼠肝組織Collagen I mRNA的表達變化

實時PCR結果顯示，正常組大鼠肝組織僅少量表達collagen I，染毒3 d時表達明顯升高，其后持續(xù)高表達，4周升高最明顯，DMN染毒停止后，collagen I mRNA水平有所下降，但仍維持在較高水平(見表2)。

五、肝組織α-SMA、MMP-2/9、TIMP-1/2、ERK/p-ERK蛋白表達變化

正常組大鼠肝組織α-SMA、MMP-2/9、TIMP-1/2蛋白均少量表達。在肝纖維化形成過程中，各蛋白表達量逐漸增加，并隨DMN染毒時間持續(xù)高表達。停止染毒后，各蛋白表達均逐漸減少，8周時MMP-2蛋白表達已接近正常水平，α-SMA、MMP-9、TIMP-1/2蛋白仍較正常組大鼠表達增多。ERK蛋白水平于正常組及模型組大鼠肝組織中無明顯變化，然而ERK磷酸化(p-ERK)水平在染毒1 d時即有輕度增加，2周時表達升高至正常組的2倍。其后在整個造模過程中p-ERK持續(xù)高表達，4周達到最高峰。停止染毒后，p-ERK水平逐漸下降，但8周時仍高于正常水平(見圖4，表3)。

圖4 大鼠肝組織α-SMA、MMP-2/9、TIMP-1/ 2、ERK/p-ERK蛋白表達變化

表2 大鼠肝組織膠原、α-SMA及MMP-2/9表達變化(±s)

表3 肝組織蛋白表達變化定量(±s)

六、模型大鼠肝組織脂質(zhì)過氧化損傷動態(tài)變化

肝纖維化形成過程中，大鼠肝組織SOD、GST活性逐漸降低(P<0.05)，停止染毒后，二者活性有所增高但仍低于正常水平。肝組織GSH含量在DMN染毒早期出現(xiàn)一過性增高，而后明顯降低(P<0.05)，在肝纖維化消退過程中，含量逐漸增加并接近正常水平(見表4)。

七、肝組織SOD活性與p-ERK蛋白表達及Hyp含量的相關性分析

直線相關分析表明，在肝纖維化形成和消退過程中，SOD活性與Hyp含量及SOD活性與p-ERK蛋白表達均呈明顯負相關(P<0.05)；p-ERK蛋白表達與Hyp含量呈明顯正相關(P<0.01)。見圖5。

討 論

DMN是一種常見的具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性的化學物質(zhì)，其主要靶器官為肝臟，高劑量使用可引起肝組織壞死和肝纖維化[7，8]。肝纖維化的形成與HSC的活化關系密切，活化HSC轉換為肌成纖維細胞，分泌大量的α-SMA和膠原沉積于肝臟，HSC還可以分泌MMP和TIMP，通過調(diào)節(jié)ECM的沉積和降解，影響肝纖維化的進展[9]。目前發(fā)現(xiàn)至少有4種TIMP存在，但僅有TIMP-1和TIMP-2在肝組織中表達[10]，TIMP-1和TIMP-2可以分別與IV型膠原酶MMP-9和MMP-2前體結合，破壞正常肝臟基質(zhì)，抑制間質(zhì)膠原酶降解膠原纖維，促使HSC進一步增殖活化。本研究發(fā)現(xiàn)，DMN染毒開始，大鼠肝組織細胞出現(xiàn)損傷壞死，膠原纖維大量沉積，在肝纖維化形成過程中肝組織內(nèi)α-SMA以及MMP-2/9和TIMP-1/2的表達量明顯增加，MMP-2/9活性明顯增高，停止染毒，肝纖維化逐漸消退，相關蛋白表達減少。

有研究發(fā)現(xiàn)，在DMN造模初期，會引起過多游離脂肪酸沉積于肝細胞，產(chǎn)生氧自由基激發(fā)脂質(zhì)過氧化，激活HSC，加快肝纖維化的進程[11]。ROS是氧化還原過程中產(chǎn)生的化學活性分子，是細胞代謝，尤其是線粒體代謝的副產(chǎn)物，當細胞ROS量超過機體抗氧化能力時可引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應導致細胞受損。生理狀態(tài)下，細胞會產(chǎn)生如SOD等抗氧化酶系維持正常的氧化平衡狀態(tài)，以保護細胞和組織免受過量ROS攻擊[12]。GST是GSH結合反應的關鍵酶，催化谷胱甘肽結合多種化合物和環(huán)氧化物，與肝細胞內(nèi)存在的SOD和過氧化氫酶等酶類抗氧化劑和還原型GSH等非酶類抗氧化物質(zhì)共同抵御ROS所致的細胞損傷。因此，酶類抗氧化劑與非酶類抗氧化物質(zhì)常用作評估氧化應激水平的指標[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化形成過程中，肝組織SOD活性、GST活性明顯降低，GSH含量在早期出現(xiàn)一過性增高，染毒1周時開始明顯降低，而停止染毒后，二者活性有所增高但仍低于正常水平。提示DMN誘導肝纖維化形成過程中，模型組大鼠體內(nèi)出現(xiàn)氧化應激反應，機體抗氧化能力降低，在停止染毒以后，脂質(zhì)過氧化損傷明顯恢復，大鼠肝組織纖維化明顯減輕，且氧化應激反應可能與DMN大鼠肝纖維化的形成和消退有關。

表4 肝組織SOD活性、GST活性及GSH含量的動態(tài)變化(±s)

圖5 SOD活性與Hyp含量及p-ERK的相關性分析

既往研究發(fā)現(xiàn)，肝組織內(nèi)ROS的過量累積，會通過脂質(zhì)過氧化作用引起肝細胞、巨噬細胞等炎癥細胞產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，從而介導HSC分化、增殖和膠原的形成[14]。還有研究認為，除上述旁分泌機制外，ROS還可以直接刺激HSC的活化和增殖[15]。為了探討氧化應激反應如何刺激HSC增殖活化，本研究觀察了近年來倍受關注的ERK信號通路。ERK通路是各種細胞因子影響HSC增殖和活化的重要通路之一，其有ERK1和ERK2兩種異構體，磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)可以轉位至細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)轉錄因子，刺激HSC增殖和活化[16-18]。本研究結果顯示，肝纖維化形成過程中，ERK蛋白水平表達在正常組及模型組大鼠肝組織沒有明顯差異，而p-ERK1/2水平在肝纖維化形成過程中明顯增加，整個染毒過程中持續(xù)高表達。停止染毒后，p-ERK1/2水平隨肝纖維化消退有所下降，但仍高于正常水平。

綜上所述，在DMN染毒過程中，模型組大鼠肝組織肝細胞損傷，抗氧化物質(zhì)SOD、GST、GSH表達量明顯下降，機體氧化應激反應明顯，HSC活化，肝纖維化形成，同時伴有MAPK/ERK信號通路p-ERK1/2的高表達；在停止染毒后，肝纖維化明顯消退，抗氧化物質(zhì)及p-ERK表達均不同程度恢復。相關性分析發(fā)現(xiàn)，抗氧化物質(zhì)SOD活性與Hyp含量呈負相關，p-ERK蛋白表達與Hyp含量呈正相關，同時肝組織SOD活性與p-ERK蛋白表達也呈負相關。表明氧化應激反應與DMN誘導大鼠肝纖維化的形成和消退有關，且其可能是通過ERK信號通路傳導影響HSC活性和肝纖維化的進程。