免疫控制與慢性乙型肝炎功能性治愈的進展與挑戰

鄭 昕， 劉 嘉， 吳 珺， 孟忠吉， 陸蒙吉， 楊東亮

1 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院 感染病科， 武漢 430022； 2 湖北醫藥學院附屬太和醫院 感染病科，湖北 十堰 442008； 3 德國杜伊斯堡-埃森大學醫學院 病毒研究所， 德國 埃森 45122

乙型肝炎疫苗接種極大地控制了HBV的傳播。但是，全球仍有約3億慢性HBV感染者，持續性HBV感染所致肝硬化及肝癌等終末期肝病依然是人類健康的重大威脅之一。雖然IFNα與核苷(酸)類似物(NAs)已應用于慢性乙型肝炎(CHB)抗病毒治療多年，并取得了巨大進步。但是IFNα仍存在副作用較大，抑制病毒復制作用有限，以及NAs需要長期服藥，停藥后易反彈，患者依從性不佳等問題[1-4]。

因此，在如何使得更多CHB患者實現功能性治愈方面仍存在巨大需求。需要在基礎研究、抗病毒藥物研發、個體化治療預測和評估指標探索以及綜合利用抗病毒與免疫調節藥物開展功能性治愈新策略等方面深入研究。本期有幸邀請到國內長期從事CHB基礎和臨床研究，尤其是在HBV感染免疫方面多有深入探索的部分團隊圍繞HBV感染免疫控制與CHB功能性治愈研究進展以及各自工作體會進行了文獻回顧和綜述。相信將有助于加深對于該領域進展的了解。

1 HBV感染的免疫控制

HBV感染的結局可以表現為急性一過性感染或持續的慢性感染。雖然迄今對于其詳細分子機制尚未完全闡明，但是已有的研究提示，HBV分子生物學特性、宿主的遺傳及免疫學因素以及兩者之間的相互作用是影響HBV感染結局的重要因素。當比較急性乙型肝炎和CHB的免疫特征時，人們普遍認為功能失調的免疫應答在持續性HBV感染和肝臟炎癥中起著重要作用[5-8]。

已知HBV cccDNA在感染肝細胞的細胞核內以微染色體的形式持續穩定存在，難以被靶向調控和清除。圍繞HBV cccDNA持續沉默或降解清除機制及策略的研究是當前CHB功能性治愈目標的重點之一[9]。本期復旦大學上海醫學院袁正宏教授團隊綜述了目前對cccDNA基本生物學特性、轉錄和代謝調控機制及相關宿主因子的認知，重點分析了cccDNA沉默清除的可能途徑和靶向調控策略。

慢性HBV感染的免疫應答特點包括：(1)HBV特異性CD4和CD8 T淋巴細胞功能障礙和衰竭；(2)樹突狀細胞(DC)和自然殺傷細胞數量減少和功能障礙；(3)調控因子表達上調/增強，包括免疫檢查點蛋白PD-1、CTLA-4、T淋巴細胞免疫球蛋白域和黏蛋白域3；(4)先天免疫應答受損，尤其是Toll樣受體(TLR)下調和功能障礙等[10-11]。本期華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院劉嘉教授團隊就肝內固有抗原遞呈細胞調控抗乙型肝炎免疫應答的作用及機制進行了介紹。陸軍軍醫大學附屬西南醫院鄧國宏教授團隊結合自己的研究體會及同行近期研究結果就CHB患者的HBV特異性T淋巴細胞是否處于耗竭狀態進行了深入討論。

為了維持體內內環境平衡，肝內免疫系統優先誘導對從門靜脈進入抗原的耐受。在持續性HBV感染中，肝臟中的抑制機制調節和抑制了T淋巴細胞的功能。研究發現，肝內炎癥反應可在肝內原位誘導多條抑制通路，導致T淋巴細胞功能抑制。受損的肝細胞可釋放精氨酸酶和吲哚胺2,3-雙氧酶等，導致氨基酸的消耗，而氨基酸對維持T淋巴細胞功能非常重要。精氨酸損耗使得T淋巴細胞CD3ζ水平降低，進而導致T淋巴細胞受體-通路功能障礙。肝內炎癥募集調節性T淋巴細胞、B淋巴細胞和髓系來源的抑制性細胞和活化的肝星狀細胞，導致IL-10和TGFβ增加。雖然肝內抑制機制對于保護由炎癥引起的嚴重損害至關重要，但是，也同時進一步損害了HBV特異性T淋巴細胞的功能[12]。

一般而言，高水平HBV DNA、HBsAg和HBeAg有助于維持針對HBV的特異性免疫耐受。因此，通過各種藥物減少外周血和肝內的HBV顆粒和蛋白是重新建立有效的HBV特異性T淋巴細胞反應的先決條件。此外，人們發現，向CHB患者過繼轉移抗-HBs陽性者骨髓可以清除受者體內的HBV，以及通過肝移植將抗-HBs陽性供者免疫細胞轉移到HBV感染受者體內能夠部分控制移植肝臟的HBV再感染，這些均提示免疫調節是有望實現CHB功能性治愈的重要策略之一[13]。

2 CHB的功能性治愈策略

2.1 基于現有抗病毒藥物的治療策略 如前所述，目前用于CHB抗病毒治療主要藥物包括IFNα與NAs兩大類，NAs主要以抑制病毒復制為主，但是HBsAg陰轉率普遍不高；IFNα具有抗病毒與免疫調節雙重作用，理論上講應具有較高的HBsAg陰轉率和血清學轉換率，但無論是普通IFNα還是PEG-IFNα，治療48周后總體HBsAg陰轉率約3%。近十余年來，國內外研究表明，利用NAs與IFNα聯合治療有可能提高部分CHB患者HBsAg陰轉率。具體方案包括起始聯合、序貫/聯合、中間聯合以及脈沖(間斷)聯合等。治療48周時HBsAg陰轉率可提高到7.3%～26%，對于部分優勢患者甚至更佳。提示NAs與IFNα聯合治療策略有利于發揮現有抗病毒藥物的潛能，有助于更多患者實現功能性治愈的目標[14-17]。

2.2 基于免疫控制機制的治療策略

2.2.1 臨床研究 隨著對HBV感染免疫控制機制認識的深入，人們意識到在有效抑制HBV復制的基礎上，如果能夠聯合免疫調節藥物如IL-2、IL-12、GM-CSF、Ⅲ型IFN (PEG-IFNλ)、重組乙型肝炎疫苗、合成肽疫苗、HBsAg/抗-HBs免疫復合物等，不僅有助于恢復并提高機體的抗病毒免疫功能，亦有助于提高HBsAg陰轉率。國內學者聯合NAs、IFN、GM-CSF及乙型肝炎疫苗使HBeAg陽性CHB初治患者的HBsAg陰轉率達到9.2%，NAs經治CHB患者HBsAg陰轉率達到15.38%，同時對肝細胞內HBsAg和cccDNA的表達均有明顯的抑制作用。此外，治療性DNA疫苗、自體DC疫苗、抗PD-1抗體、TLR-7/8受體激動劑以及新型的生物免疫調節劑AIC649等多種免疫調節劑正在臨床試驗中[5-8]。

總之，基于免疫控制的治療策略是通過活化和調節肝內天然免疫和獲得性免疫、靶向精準清除HBV感染的肝細胞，并減少肝組織損傷。本期南方醫科大學附屬南方醫院張小勇教授團隊及南方醫科大學附屬深圳市第三人民醫院張政教授團隊分別圍繞HBV感染相關天然免疫應答的研究進展、激活肝內天然免疫應答治愈CHB的新策略以及恢復或者增強HBV特異性T淋巴細胞和B淋巴細胞的功能進而實現CHB功能性治愈策略進行了詳細介紹。

2.2.2 基礎研究 針對TLR配體、RIG-I激動劑、STING激動劑、APOBEC3等天然免疫分子通路的基礎研究提示，天然免疫的觸發導致抗HBV應答和炎癥介質的產生，并在不同程度上抑制病毒復制[18-25]。然而，僅激活天然免疫可能無法控制HBV感染，適應性免疫的誘導可能更為重要[26-29]。阻斷免疫負調控信號進而增強特異性T淋巴細胞免疫的策略取得了一定進展，如聯合應用PD-L1抗體、恩替卡韋和DNA免疫在土撥鼠肝炎病毒感染的土撥鼠中成功增強了病毒特異性T淋巴細胞功能，導致病毒復制持續受到了抑制，在部分動物體內清除了土撥鼠肝炎病毒表面抗原并產生了土撥鼠肝炎病毒表面抗體[30-32]。

此外，蛋白質/多肽疫苗、DNA疫苗、基于病毒的疫苗、DC疫苗也被用于探索恢復和重建慢性HBV感染者受損的適應性免疫。鑒于降低HBV抗原尤其是HBsAg水平將有助于適應性免疫的恢復，有學者對抗-HBs介導的免疫治療策略進行了探索，雖然可以降低HBV DNA水平，但并未能實現持久的HBV抑制[33-35]。隨著基因編輯和細胞工程技術進步，HBV特異性T淋巴細胞療法成為可能。研究[36]表明，利用嵌合抗原受體T淋巴細胞免疫療法和T淋巴細胞受體-T淋巴細胞技術產生的HBV特異性T淋巴細胞過繼轉移有利于HBV感染的免疫控制。但是其治療CHB的有效性和安全性尚有待研究。

3 免疫控制治療策略相關預測和評估指標

3.1 病毒學生物標志物 潛在的病毒學生物標志物包括如下幾種。(1)血清HBsAg：由HBV cccDNA或整合的病毒DNA指導表達。HBsAg陰轉是功能性治愈的主要標準之一。需要建立更敏感的以及能夠區分來自整合HBV DNA和cccDNA的HBsAg的檢測方法。(2)HBV cccDNA：迄今，尚缺乏標準化的肝內HBV cccDNA定量和轉錄活性分析，基于定量PCR的檢測方法正在標準化。(3)循環HBV RNA：可以作為肝內cccDNA轉錄活性的直接指標。但是對于循環中HBV RNA的多樣性、它們是如何被包裝和釋放的以及它們與cccDNA水平的相關性仍有待深入研究。定量分析方法也需要進一步優化。(4)血清乙型肝炎核心相關抗原(HBcrAg)：HBcrAg水平與血清HBV DNA、肝內cccDNA和總HBV DNA水平密切相關，與血清HBsAg水平中度相關。HBcrAg的存在似乎預示著NAs治療中止后病毒復發。由于許多HBeAg陰性患者無法檢測到HBcrAg使得其臨床價值受到限制，提高檢測靈敏度有可能解決這一問題[37-38]。

3.2 免疫學生物標志物 由于CHB患者個體間遺傳和免疫學背景差異較大，對外周血及肝內免疫細胞進行動態分析，將有助于基于感染免疫控制的功能性治愈策略的療效預測及評估。流式細胞術、ELISOPT和ELISA等技術已經廣泛用于分析HBV感染者體內細胞因子水平、免疫細胞表型和功能。但是，這些技術的標準化如HBV肽庫的選擇和四聚體質量的控制仍是巨大挑戰。此外，雖然肝內免疫細胞及單細胞分析更能準確和全面反映患者免疫狀態，但是肝活檢的有創性極大地限制了其臨床廣泛應用。隨著對B淋巴細胞在HBV感染免疫控制中重要性的認識，建立和完善B淋巴細胞表型及功能分析方法已成為乙型肝炎功能性治愈研究中亟待解決的重要問題之一[5-6]。

4 小結與展望

實現CHB功能性治愈有兩種策略：(1)利用直接抗病毒藥物在不殺死感染細胞的情況下抑制HBV復制，進而清除HBV；(2)利用免疫調節藥物及分子恢復和重建CHB患者受損的免疫控制機制，安全清除HBV及其感染的肝細胞。現有資料提示，聯合兩種策略對患者進行個體化治療與管理將是大多數CHB患者實現功能性治愈目標的重要途徑。但是，如何實現兩者的有效聯合與精準調控，既能實現CHB的“治愈”，又不會造成嚴重的肝損傷和疾病進展仍是有待深入研究和解決的重大課題。

在HBV感染免疫控制機制中，HBV特異性T淋巴細胞應答扮演了極為重要的角色。但是，其他免疫細胞如B淋巴細胞、自然殺傷細胞、其他非實質性肝細胞、肝內微環境，以及非免疫性遺傳等因素對控制HBV復制及清除HBV的重要作用亦越來越得到重視。這方面的研究值得進一步深入。此外，深入探索CHB免疫控制治療策略相關的預測和評估指標，對CHB患者肝內受HBV感染肝細胞數量的精確量化研究不僅有利于更多患者實現功能性治愈，而且也有助于避免免疫調節治療相關肝臟毒性，使得治療過程更加安全。

總之，不論是在基礎研究、新藥研發、最優治療目標人群確定、療效預測和評估指標，還是抗病毒與免疫調節聯合治療方案及個體化治療與管理策略等方面仍存在許多有待解決的問題和挑戰，但CHB的功能性治愈仍是可實現的治療目標。相信隨著研究的深入，消除HBV對人類健康的威脅將不再遙遠。