BCG表面糖脂的分離與純化鑒定

詹紅偉*，劉鑒霄*，劉 昊，張正衍，姚 遠，張 穎，王嘉琪，王東鑫

(1.蘭州大學第二臨床醫學院，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000)

1 研究方法

1.1 制備培養基

蘇通培養基(1000m1):硫酸鎂0.5 g；檸檬酸2 g；磷酸氫二鉀0.8 g；L-谷氨酸鈉5 g；檸檬酸鐵胺0.05 g；甘油60 mL，硫酸鋅0.01 g。加超純水溶解完全，氨水調PH至7.2～7.4，分裝至500 mL三角瓶及200 ml/瓶。

1.2 接種BCG

取活化后的菌種，取適量菌液分別接種到500m1及250ml的蘇通培養基中，衡溫培養至培養基的液面富集一定厚度的菌體層。將培養基中菌體進行抽濾收集，后用PBS溶液洗滌兩次，置于試管中在4℃冰箱中進行保存。

1.3 BCG表面糖脂萃取

1.3.1 搖床

事先將所需的錐形瓶、玻璃珠以及混合液（氯仿：甲醇=2：1）進行高壓蒸汽滅菌，將試管中所收集的菌體置于已滅菌的錐形瓶，每個250ml錐形瓶中加入4 g菌體，20g玻璃珠以及100ml的混合溶液，以上所有操作均在無菌操作臺中完成。以8種方案進行糖脂提取：搖床轉速：方案一：100 rpm；二：150 rpm；三：200 rpm；四：250 rpm；五：100 rpm；六：150 rpm；七：200 rpm；八：250 rpm。搖床時間一至四為5 min；五至八為2 min。離心轉速各為5000rpm。離心時間各為10 min。

1.3.2 離心

裝入50 mL的離心管中，并且用天平配平使試管質量相近，后進行以5000rpm離心10min，使菌體與糖脂分層，收集上清液。

1.3.3 旋轉蒸發儀濃縮上清液

將離心后的上清液以10X、15X、20X濃縮，置于10 mL試管中。將試管置于-20℃冰箱中保存。經薄層色譜染色分析，20倍濃縮。

1.4 BCG表面糖脂的純化

1.4.1 過柱前薄層色譜法分析：用微量移液器量取10 uL在硅膠板上進行點狀點樣，將硅膠板斜放入層析缸中，用氯仿:甲醇:丙酮:乙酸((90:10:6:1)展開劑展開，當展開劑前緣距硅膠板上端1 cm處，取出硅膠板吹干。

1.4.2 硅膠柱層析法純化

稱取l00 g 200～300目硅膠粉末，用300 mL氯仿浸泡過夜;勻漿濕法裝柱，調整流速，并使用250 mL～500 mL的氯仿平衡硅膠柱。

取5 mL上清液進行上樣，以氯仿/甲醇混合液為流動相，在不同比例氯仿/甲醇梯度洗脫條件下分離總脂，柱層析流速控制在1ml/min。以三種洗脫液進行糖脂的洗脫：

①氯仿:甲醇99:1；②氯仿:甲醇9:1；③氯仿:甲醇，96:4

1.4.3 過柱后薄層色譜法分析

將洗脫產物在10xl0 cm規格硅膠板上點樣，點樣為9 cm左右線狀，待樣品干燥后，斜放入層析缸中，用氯仿:甲醇:丙酮:乙酸((90:10:6:1)展開劑展開，當展開劑前緣距硅膠板上端1cm處，取出硅膠板吹干，進行碘染，觀察染色效果，并于之前洗脫前染色結果進行對比。

2 結果與分析

2.1 總脂萃取結果

BCG大量培養后，收集菌體，并使用高速離心機分離糖脂和菌體，取上清液，將離心后的上清液置于旋轉蒸發儀中濃縮至10X，15X，20X，再經薄層色譜染色分析，得出20X濃縮染色效果最佳。根據硅膠板上條帶數可觀察出濃縮后的上清液均有較多成分且含量不一，經過對比發現方案二（150 rpm 5 min）的所取得的粗糖脂成分相對較少，可做為后期備選方案。

2.2 糖脂的分離純化結果

硅膠經過氯仿浸泡過夜充分溶脹后，均勻裝柱（柱長30 cm，直徑2 cm），過程中持續用玻璃棒敲打防止氣泡產生，調整流速1ml/min，總脂（溶劑為甲醇：氯仿=1：2）上樣5ml左右，依次用50ml氯仿：甲醇=99：1，50ml氯仿：甲醇=9：1，50ml氯仿：甲醇=96:4的有機體系進行洗脫，收集洗脫液，將方案二的于其余薄層色譜分析圖進行對比，其成分相對較少，并且僅有經過洗脫液（氯仿：甲醇=9:1）過柱后顯示明顯條帶，其余方案過柱后的三種洗脫液均有不同程度的顯帶，且條帶數較多，說明其洗脫液成分相對較多，其次再根據總脂萃取結果可大致認為方案二的BCG糖脂純化方法較優于其他方案。

2.4 糖脂成分分析

為了檢測過柱后洗脫液是否存在核酸和蛋白質等雜質，我們將硅膠柱層析所得24種洗脫液進行核酸電泳凝膠分析和蛋白質凝膠電泳分析。

2.4.1 核酸凝膠電泳分析結果

24種洗脫液經核酸凝膠電泳分析并進行凝膠攝影后得出，圖中熒光亮點即為核酸所在位置，可觀察到第1、6、8、9、15、20、21號試管中有熒光出現，故可分析出方案一、方案三、方案五、方案七中經過柱的洗脫液均含核酸雜質，又根據其核酸所在位置與DL 15000 DNA Ladder標準條帶位置對比，可觀察出洗脫液中核酸分子量較大，結核分歧桿菌的全基因組序列約為4.41Mb，有3942個開放閱讀框，約4000個基因；在實驗方案中可能由于轉速過高使玻璃珠對菌體的破壞較大，使菌體破裂釋放出核酸分子，后者被EB染色，在紫外光下可發出熒光，且核酸凝膠電泳僅可分離長度為200dp至50kb的核酸分子，這可以解釋凝膠攝影所出現的核酸位置僅在點樣部位的現象。

2.4.2 SDS-PAGE分析結果

24種洗脫液經蛋白質凝膠電泳分析后拍攝后得出，將24種洗脫液和標準蛋白樣所跑條帶進行對比，可發現24種洗脫液均無蛋白條帶出現，因此初步確定24種洗脫液中無蛋白質雜質。

3 討 論

本實驗通過自己創新性提脂方法和前人純化方法相結合，我們從BCG菌體中分離出來了部分糖脂，早期預實驗用PBS作為提取糖脂的溶液，但運用旋轉蒸發儀進行上清液濃縮時，在不破壞糖脂內部結構的情況下進行蒸發，溫度控制在了60度，但PBS緩沖溶液的沸點遠遠比其高得多，故無法將PBS進行濃縮，于是想到了高壓冷凍濃縮儀，我們準備將提取粗糖脂的溶液改為PBS溶液進行，若分離效果明顯，可將濃縮后的上清液進行再次濃縮至1ml，待自然揮發干燥后免疫小鼠，通過檢測小鼠血清中結核桿菌相關IgG類抗體產生情況來進一步對其免疫活性進行研究，若免疫活性較為理想，該糖脂可有望成為亞單位疫苗的新型佐劑，為亞單位疫苗的研究提供了理論和物質基礎。

4 結 論

根據對八種實驗方案結果進行分析，BCG表面糖脂最優方案為150 rpmX5 min。