基因檢測結核分枝桿菌異煙肼、利福平耐藥與液體培養法對比的臨床價值

李俊，劉君君，張宇，熊峰，趙建，劉錦宏

（荊州市胸科醫院，湖北 荊州 434000）

0 引言

結核病是比較常見的一種疾病，近年來，因為治療不規范或藥物濫用的影響，耐多藥結核病（multidrug resistance tuberculosis，MDR-TB）在我國的發病率呈現出明顯的上升趨勢，其患者數量居于世界首位，并且也是全球22 個耐多藥高負擔的國家之一[1]。在結核病的臨床治療中，利福平和異煙肼是比較常見的藥物，也是診斷耐多藥結核病的一個有效依據，通過檢測其耐藥性，不僅可以及時診斷耐多藥患者，還可以為制定針對性治療方案提供有效依據[2]。溶解曲線法是近幾年新發展的結核耐藥檢測方法，以該方法為基礎研發的異煙肼、利福平耐藥突變檢測試劑盒于2013 年1 月獲頒國家食品藥品（SFDA）監督管理局醫療器械注冊證書。因此，本文對結核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥診斷中運用基因檢測的臨床價值進行了探討，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018 年2 月至2019 年7 月我院收治的結核病患者膿液、灌洗液、腦脊液、胸腹腔積液以及痰液經培養證實為結核分支桿菌的180 例陽性標本為研究對象，其中女75 例、男105 例，年齡25-72 歲，平均（48.6±12.5）歲。

1.2 方法

（1）藥敏實驗。稀釋菌液：運用22SWG 標準接種環取2 滿環1mg/mL 的靜置好的結核菌菌液放入滅菌生理鹽水2mL 中，先稀釋為10-2mg/mL 的菌液，然后再用同樣的方法進行100 倍稀釋，即10-4mg/mL 菌液。接種：運用22SWG 標準接種環取1 滿環在對照及已經配制好的含藥培養基斜面上均勻接種，使最終菌液接種濃度為10-6mg/mL 和10-4mg/mL，若培養菌落數＞50 個，則可判斷為耐藥。同時，樣本接種：①在藥敏試管架上放入MGIT試管；②將0.8mL S.I.R.E Supplement 加入MGTT 試管；③在相應的MGIT 試管中分別加入S.I.R.E 藥物100μL；④對生長對照菌液進行準備，即在無菌生理鹽水10mL 中放入100μL 菌液，作1:100 稀釋，均勻混合；⑤取稀釋后的菌液0.5mL 放入生長對照管，均勻混合；⑥將0.5mL未稀釋的菌液分別加入藥敏管中，均勻混合；⑦上機培養6-12d 后，儀器自動報告藥敏結果。

（2）熒光PCR 溶解曲線法檢測異煙肼和利福平耐藥。運用標準接種環對固體進行收集，離心用250μL 的TB DNA 提取液重懸后放入99℃中進行2min 加熱，離心后在配制好的含有20μL PCR 反應液的反應管中加入5μL 上清液，并且運用Lightcycler 480 PCR 儀中進行擴增和溶解曲線分析。判定結果：若樣品的Tm 值低于陽性對照2℃或以上則為突變型；若樣品的Tm 值與陽性對照的Tm值基本一致則為野生型。

1.3 測序分析

對傳統藥敏法和基因檢測熒光PCR 溶解曲線法不一致的樣本進行測序分析。同時，運用傳統法為金標準來對熒光PCR 溶解曲線法的特異度和靈敏度進行計算，并且對兩種方法的符合率進行評價。

1.4 統計學分析

由SPSS 20.0 軟件分析數據，組間計數資料比較行χ2檢驗，并且以P＜0.05 表示有差異。

2 結果

2.1 兩種方法符合率

兩種方法檢測結核分枝桿菌利福平、異煙肼的耐藥性符合率比較無差異（P＞0.05），見表1。

表1 兩種方法符合率對比[n（%）]

2.2 溶解曲線法檢測利福平和異煙肼的各項指標比較

溶解曲線法檢測異煙肼的特異度以及靈敏度分別為93.9%、85.4%；而利福平則為97.1%、92.3%，見表2。

表2 溶解曲線法檢測異煙肼和利福平的各項指標對比

3 討論

近年來，隨著耐藥結核病患者人數的增加，在結核病患者的臨床治療中，耐藥問題已經成為當前迫切需要解決的一個問題，所以選擇一種合適的方法檢測結核病的耐藥性有著極其重要的意義[3]。《2016 年耐藥結核指南》是WHO 對近年來耐藥結核病治療及分子生物學、外科診治等方面研究成果的總結[4-6]。快速診斷技術進行測試的方法和更短、療效更好的耐多藥結核病治療方案給我們帶來了新的希望[7-9]。在結核分枝桿菌異煙肼、利福平的耐藥檢測中，傳統的液體培養法是比較常用的一種方法，但是需要較長的周期，并且操作比較復雜，在一定程度上限制了臨床應用。而基因芯片技術作為一種分子生物學技術，將生物芯片的高通量性和分子生物學的高靈敏度相結合，具有準確、靈敏以及快速的優點，可以被廣泛運用在結核菌耐藥性檢測中[10-13]。綜上所述，臨床上在檢測結核分枝桿菌異煙肼和利福平的耐藥中，相比較液體培養法而言，基因檢測法具有快速、準確率高的優點，可以作為有效的一種方法，具有一定的推廣應用價值。