基因檢測結(jié)核分枝桿菌異煙肼、利福平耐藥與液體培養(yǎng)法對比的臨床價值

李俊，劉君君，張宇，熊峰，趙建，劉錦宏

（荊州市胸科醫(yī)院，湖北 荊州 434000）

0 引言

結(jié)核病是比較常見的一種疾病，近年來，因為治療不規(guī)范或藥物濫用的影響，耐多藥結(jié)核病（multidrug resistance tuberculosis，MDR-TB）在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，其患者數(shù)量居于世界首位，并且也是全球22 個耐多藥高負(fù)擔(dān)的國家之一[1]。在結(jié)核病的臨床治療中，利福平和異煙肼是比較常見的藥物，也是診斷耐多藥結(jié)核病的一個有效依據(jù)，通過檢測其耐藥性，不僅可以及時診斷耐多藥患者，還可以為制定針對性治療方案提供有效依據(jù)[2]。溶解曲線法是近幾年新發(fā)展的結(jié)核耐藥檢測方法，以該方法為基礎(chǔ)研發(fā)的異煙肼、利福平耐藥突變檢測試劑盒于2013 年1 月獲頒國家食品藥品（SFDA）監(jiān)督管理局醫(yī)療器械注冊證書。因此，本文對結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥診斷中運(yùn)用基因檢測的臨床價值進(jìn)行了探討，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018 年2 月至2019 年7 月我院收治的結(jié)核病患者膿液、灌洗液、腦脊液、胸腹腔積液以及痰液經(jīng)培養(yǎng)證實為結(jié)核分支桿菌的180 例陽性標(biāo)本為研究對象，其中女75 例、男105 例，年齡25-72 歲，平均（48.6±12.5）歲。

1.2 方法

（1）藥敏實驗。稀釋菌液：運(yùn)用22SWG 標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)取2 滿環(huán)1mg/mL 的靜置好的結(jié)核菌菌液放入滅菌生理鹽水2mL 中，先稀釋為10-2mg/mL 的菌液，然后再用同樣的方法進(jìn)行100 倍稀釋，即10-4mg/mL 菌液。接種：運(yùn)用22SWG 標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)取1 滿環(huán)在對照及已經(jīng)配制好的含藥培養(yǎng)基斜面上均勻接種，使最終菌液接種濃度為10-6mg/mL 和10-4mg/mL，若培養(yǎng)菌落數(shù)＞50 個，則可判斷為耐藥。同時，樣本接種：①在藥敏試管架上放入MGIT試管；②將0.8mL S.I.R.E Supplement 加入MGTT 試管；③在相應(yīng)的MGIT 試管中分別加入S.I.R.E 藥物100μL；④對生長對照菌液進(jìn)行準(zhǔn)備，即在無菌生理鹽水10mL 中放入100μL 菌液，作1:100 稀釋，均勻混合；⑤取稀釋后的菌液0.5mL 放入生長對照管，均勻混合；⑥將0.5mL未稀釋的菌液分別加入藥敏管中，均勻混合；⑦上機(jī)培養(yǎng)6-12d 后，儀器自動報告藥敏結(jié)果。

（2）熒光PCR 溶解曲線法檢測異煙肼和利福平耐藥。運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)對固體進(jìn)行收集，離心用250μL 的TB DNA 提取液重懸后放入99℃中進(jìn)行2min 加熱，離心后在配制好的含有20μL PCR 反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入5μL 上清液，并且運(yùn)用Lightcycler 480 PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增和溶解曲線分析。判定結(jié)果：若樣品的Tm 值低于陽性對照2℃或以上則為突變型；若樣品的Tm 值與陽性對照的Tm值基本一致則為野生型。

1.3 測序分析

對傳統(tǒng)藥敏法和基因檢測熒光PCR 溶解曲線法不一致的樣本進(jìn)行測序分析。同時，運(yùn)用傳統(tǒng)法為金標(biāo)準(zhǔn)來對熒光PCR 溶解曲線法的特異度和靈敏度進(jìn)行計算，并且對兩種方法的符合率進(jìn)行評價。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

由SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，組間計數(shù)資料比較行χ2檢驗，并且以P＜0.05 表示有差異。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法符合率

兩種方法檢測結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼的耐藥性符合率比較無差異（P＞0.05），見表1。

表1 兩種方法符合率對比[n（%）]

2.2 溶解曲線法檢測利福平和異煙肼的各項指標(biāo)比較

溶解曲線法檢測異煙肼的特異度以及靈敏度分別為93.9%、85.4%；而利福平則為97.1%、92.3%，見表2。

表2 溶解曲線法檢測異煙肼和利福平的各項指標(biāo)對比

3 討論

近年來，隨著耐藥結(jié)核病患者人數(shù)的增加，在結(jié)核病患者的臨床治療中，耐藥問題已經(jīng)成為當(dāng)前迫切需要解決的一個問題，所以選擇一種合適的方法檢測結(jié)核病的耐藥性有著極其重要的意義[3]。《2016 年耐藥結(jié)核指南》是WHO 對近年來耐藥結(jié)核病治療及分子生物學(xué)、外科診治等方面研究成果的總結(jié)[4-6]。快速診斷技術(shù)進(jìn)行測試的方法和更短、療效更好的耐多藥結(jié)核病治療方案給我們帶來了新的希望[7-9]。在結(jié)核分枝桿菌異煙肼、利福平的耐藥檢測中，傳統(tǒng)的液體培養(yǎng)法是比較常用的一種方法，但是需要較長的周期，并且操作比較復(fù)雜，在一定程度上限制了臨床應(yīng)用。而基因芯片技術(shù)作為一種分子生物學(xué)技術(shù)，將生物芯片的高通量性和分子生物學(xué)的高靈敏度相結(jié)合，具有準(zhǔn)確、靈敏以及快速的優(yōu)點，可以被廣泛運(yùn)用在結(jié)核菌耐藥性檢測中[10-13]。綜上所述，臨床上在檢測結(jié)核分枝桿菌異煙肼和利福平的耐藥中，相比較液體培養(yǎng)法而言，基因檢測法具有快速、準(zhǔn)確率高的優(yōu)點，可以作為有效的一種方法，具有一定的推廣應(yīng)用價值。