二氫楊梅素減輕氧糖剝奪/再灌注所致的神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷及機(jī)制

李 娜，曹 翔

腦卒中具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類健康。缺血性腦卒中約占全部卒中的80%左右,目前臨床上唯一公認(rèn)有效的血管內(nèi)再通治療因時間窗和并發(fā)癥的限制，只有不到4%的患者從中獲益[1]。因此，研究新的治療靶點(diǎn)和方法尤為重要。

氧化應(yīng)激已被證實(shí)是影響缺血性腦卒中預(yù)后的重要因素之一[2]。降低氧化應(yīng)激水平可以顯著減輕腦損傷[3，4]。缺血性腦卒中發(fā)生后，活性氧(reactive oxygen species,ROS)和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(malonaldehyde,MDA)過度產(chǎn)生，內(nèi)源性抗氧化酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等活性下降，導(dǎo)致抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力無法發(fā)揮作用，這些對神經(jīng)元等細(xì)胞造成巨大損害[5,6]。因此，尋找可以抑制氧化應(yīng)激的藥物，將成為有效治療缺血性卒中的策略。二氫楊梅素(ampelopsin,Amp)是從藤茶中提取的一種黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎癥等多種作用[7,8]。近期有研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素具有改善阿爾茨海默病大鼠的記憶損傷，可能是通過抑制神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，但具體的機(jī)制和作用的靶點(diǎn)不明[9]。對于二氫楊梅素是否可以減輕缺血再灌注造成的神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，尚未見文獻(xiàn)報道。

本實(shí)驗(yàn)通過建立體外神經(jīng)元細(xì)胞氧糖剝奪/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型來模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷，研究二氫楊梅素對神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑 二氫楊梅素(CAS號27200-12-0，純度98%)購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒、活性氧檢測試劑盒、SOD活性檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒購自碧云天公司。Nrf2、HO-1、Lamin B、GAPDH抗體以及對應(yīng)種屬的二抗均購自美國Cell Signaling公司。Neurobasal、無糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、B27血清類似物購自美國Gibco公司。

1.2 大腦皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)方法參考之前研究[10]，簡述如下：取15～17 d齡的C57BL/6胎鼠腦組織，盡可能的去掉所有的血管和血管膜，分離大腦皮質(zhì)并剪碎，胰蛋白酶消化10 min后接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的含B27的Neurobasal培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2～3 d半換液。利用特異性抗體MAP-2檢測，陽性率大于95%后可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 OGD/R模型建立及給藥方式 取生長至10 d的成熟原代皮質(zhì)神經(jīng)元，將培養(yǎng)基替換成不含葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基后再將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入缺氧小室中。小室內(nèi)充入95%N2和5%CO2的混合氣10 min，將閥門密封后將小室在37 ℃下孵育20 min(氧糖剝奪階段)。最后將細(xì)胞培養(yǎng)皿取出，更換正常神經(jīng)元培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h(再灌注階段)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對照細(xì)胞一直在正常培養(yǎng)基和環(huán)境中培養(yǎng)。二氫楊梅素溶于二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),于再灌注階段開始時以適當(dāng)濃度稀釋于培養(yǎng)基中，作用神經(jīng)元。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活性 將96孔板中成熟的原代神經(jīng)元細(xì)胞OGD處理，再灌注時與不同濃度二氫楊梅素共孵育24 h，然后每孔加入10 μl CCK-8工作液，37 ℃孵育2 h后置于450 nm波長下檢測吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個復(fù)孔，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 細(xì)胞ROS水平檢測 將OGD/R和藥物處理完畢的神經(jīng)元細(xì)胞用PBS洗3次，加入終濃度為10 μmol/L的 DCFH-DA在37 ℃避光孵育30 min。待孵育結(jié)束后，再用PBS洗3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組ROS的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個復(fù)孔，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 SOD活性和MDA含量測定 細(xì)胞處理結(jié)束，利用經(jīng)典的氮藍(lán)四唑顯色法測定SOD活性，硫代巴比妥酸顯色反應(yīng)來定量檢測MDA的含量。

1.7 細(xì)胞核質(zhì)分離與免疫印跡 將OGD/R和藥物處理完畢的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗3遍，棄去PBS后加入細(xì)胞質(zhì)裂解液(含蛋白酶抑制劑)冰上裂解30 min，接著用細(xì)胞刮板將細(xì)胞完全刮下，4 ℃ 12500 rpm/min離心30 min，上清為細(xì)胞質(zhì)蛋白。沉淀部分再與細(xì)胞核裂解液冰上孵育20 min，同樣離心方式得到的上清為核蛋白。BCA法定量每組樣品后取等量蛋白上樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后恒壓轉(zhuǎn)膜，接著用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜。次日用相應(yīng)種屬來源的二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯影，用Image J軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 二氫楊梅素對神經(jīng)元細(xì)胞活性及OGD/R后細(xì)胞存活率的影響 研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素在150 μg/ml(大約是468 μmol/L)的濃度下對小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7活力沒有影響[11]。為了進(jìn)一步檢測二氫楊梅素對原代神經(jīng)元細(xì)胞的毒性情況，我們運(yùn)用CCK8法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果(見圖1)，與對照組相比，1～30 μmol/L的二氫楊梅素對原代神經(jīng)元細(xì)胞活性影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但是50 μmol/L的二氫楊梅素顯著降低了神經(jīng)元細(xì)胞活性(P<0.01)。接下來，我們繼續(xù)觀察是否二氫楊梅素可以降低OGD/R造成的神經(jīng)元細(xì)胞死亡率。在OGD/R的一開始，我們加入0～30 μmol/L濃度的二氫楊梅素作用于原代神經(jīng)元細(xì)胞24 h后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L 和30 μmol/L的二氫楊梅素均顯著提高了OGD/R造成的細(xì)胞死亡率(OGD/R+20 μmol/L Amp vs OGD，P<0.05；OGD/R+30 μmol/L Amp vs OGD，P<0.01)(見圖1)。這些結(jié)果證明二氫楊梅素在其無藥物毒性濃度的情況下表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用，并在30 μmol/L濃度下保護(hù)效果最佳，故我們以30 μmol/L的二氫楊梅素作為后續(xù)研究的藥物濃度。

圖1 二氫楊梅素對神經(jīng)元細(xì)胞活性及OGD/R后細(xì)胞存活率的影響。與對照組比較**P<0.01；與OGD/R組比較#P<0.05， ##P<0.01

2.2 二氫楊梅素減少OGR/R引起的細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá) 30 μmol/L的二氫楊梅素處理OGD/R的原代神經(jīng)元細(xì)胞24 h，熒光顯微鏡檢測細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞的ROS表達(dá)量很低，而OGD/R刺激組，ROS含量顯著增加(P<0.01)，運(yùn)用二氫楊梅素處理的神經(jīng)元細(xì)胞ROS的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2)。

圖2 二氫楊梅素減少OGD/R引起的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)。與對照組比較**P<0.01；與OGD/R組比較##P<0.01。標(biāo)尺100 μm

2.3 二氫楊梅素對OGD/R神經(jīng)元SOD活性和MDA含量的影響 在觀察到二氫楊梅素可以減少ROS的產(chǎn)生后，我們進(jìn)一步檢測抗氧化酶SOD以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，OGD/R組神經(jīng)元SOD活性明顯降低，而MDA水平顯著增高。在二氫楊梅素處理組中，其顯著提高了神經(jīng)元細(xì)胞SOD的活性并降低MDA的含量(見圖3)。

圖3 二氫楊梅素對OGD/R所致神經(jīng)元SOD活性和MDA含量的影響。與對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與OGD/R組比較#P<0.05

2.4 二氫楊梅素對OGD/R神經(jīng)元Nrf2/HO-1信號通路的影響 核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)通路在細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用，其中HO-1是公認(rèn)的具有抗氧化功能的分子，在許多疾病中起著重要的保護(hù)作用，而HO-1的表達(dá)是由Nrf2所誘導(dǎo)[12]。我們在這部分研究中觀察二氫楊梅素是否能影響Nrf2/HO-1信號通路從而減輕OGD/R造成的氧化應(yīng)激損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素的處理上調(diào)了HO-1的表達(dá)，同時增加Nrf2在細(xì)胞核中的表達(dá)，使得更多的Nrf2在核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能(見圖4)。

圖4 二氫楊梅素對OGD/R神經(jīng)元Nrf2/HO-1信號通路的影響。與對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與OGD/R組比較#P<0.05， ##P<0.01

3 討 論

氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注造成的腦損傷過程中起著非常重要的作用[12]。氧化應(yīng)激損傷發(fā)生后，腦細(xì)胞中的抗氧化物質(zhì)被大量消耗，造成細(xì)胞內(nèi)促氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，進(jìn)而引起神經(jīng)元細(xì)胞死亡。因此，增加細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)、減少促氧化的產(chǎn)物生成是降低細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的重要手段之一。

在我國南方，藤茶是一種功能性飲料，它具有多種生物學(xué)功能，而二氫楊梅素是藤茶的主要成分[13]。我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素可以通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB與JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮抗炎作用[8]。一項(xiàng)關(guān)于黃酮類化合物神經(jīng)保護(hù)的研究中，已經(jīng)證實(shí)二氫楊梅素能夠通過血腦屏障發(fā)揮作用[14]。有研究表明，在阿爾茨海默癥動物模型中，利用二氫楊梅素治療不僅可以改善行為學(xué)缺損，還可改善γ氨基丁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時能夠抑制神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生[9,15]。然而，關(guān)于二氫楊梅素對缺血再灌注造成的神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的作用知之甚少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：二氫楊梅素可以顯著提高體外OGD/R后的神經(jīng)元細(xì)胞存活率，降低ROS水平，提高抗氧化酶SOD活性，并減少脂質(zhì)過氧化物MDA的表達(dá)。這些提示我們，二氫楊梅素可以保護(hù)神經(jīng)元對抗體外OGD/R造成的細(xì)胞死亡，這與其降低了氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

Nrf2抗氧化通路在響應(yīng)氧化應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮重要作用[12,16]。正常生理狀態(tài)下，Nrf2位于細(xì)胞質(zhì)中，不能進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后，Nrf2會轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與Maf蛋白形成異二聚體，并和抗氧化反應(yīng)原件ARE結(jié)合從而激活包括HO-1在內(nèi)的許多抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄，共同抵御外來的有害刺激[17]。Nrf2的基因敲除小鼠與正常小鼠相比，抗氧化應(yīng)激的效應(yīng)明顯減弱。HO-1作為Nrf2下游蛋白之一，實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在短暫性全腦缺血模型、短暫和永久性大腦中動脈栓塞模型、以及光栓模型中的表達(dá)均是下調(diào)的[18，19]。HO-1基因敲除小鼠，腦梗死體積顯著增大。提高HO-1的表達(dá)，則能夠減輕缺血再灌注造成的腦損傷[20]。因此，在本研究中我們推測二氫楊梅素有效的降低ROS、MDA水平，促進(jìn)SOD活性增強(qiáng)可能與Nrf2/HO-1抗氧化通路有關(guān)。于是，在接下來的實(shí)驗(yàn)中，我們利用免疫印跡技術(shù)檢測了HO-1蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素處理后可以增加OGD/R神經(jīng)元細(xì)胞的HO-1表達(dá)。同時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)調(diào)控HO-1表達(dá)的Nrf2蛋白核質(zhì)轉(zhuǎn)移也受到影響，二氫楊梅素的處理導(dǎo)致了更多的Nrf2進(jìn)入核內(nèi)，具有轉(zhuǎn)錄更多抗氧化物質(zhì)的潛力。

綜上所述，二氫楊梅素抑制OGD/R所致的原代神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，可能是通過激活Nrf2/HO-1抗氧化通路來實(shí)現(xiàn)的。本研究進(jìn)一步豐富了二氫楊梅素在缺血再灌注損傷的運(yùn)用價值，并為缺血性腦卒中的治療提供新的干預(yù)手段和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。