基于激光共聚焦顯微鏡的綠色熒光融合蛋白質(zhì)微米環(huán)形貌分析

胡 坤

利用分子生物技術(shù)判斷蛋白質(zhì)的不同功能，進而設(shè)計具有復(fù)合功能的融合蛋白，使蛋白質(zhì)能夠按照特定規(guī)則進行連接，改善原蛋白質(zhì)的生物功能，在此過程中，對蛋白質(zhì)微米環(huán)形貌進行分析，理解天然蛋白質(zhì)精確組裝過程，具有重要的現(xiàn)實意義［1］.

文獻［2］提出利用PTD 的轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，根據(jù)不同種類PTD 的結(jié)構(gòu)性質(zhì)對蛋白質(zhì)微米環(huán)進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，獲取多種蛋白質(zhì)的精氨酸和賴氨酸特性，將其作為PTD 發(fā)揮轉(zhuǎn)導(dǎo)的必要條件，基于蛋白質(zhì)的螺旋結(jié)構(gòu)獲得具有生物學(xué)活性的微米環(huán)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)磷脂間的氫鍵相結(jié)合，記錄PTD 融合蛋白質(zhì)陷于胞內(nèi)體的現(xiàn)象，提高蛋白質(zhì)相互作用的預(yù)測性能，避免抑制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以此得到多個基因功能疊加的微米環(huán)表達產(chǎn)物.文獻［3］提出分析蛋白質(zhì)的獨立結(jié)構(gòu)域，對蛋白質(zhì)微米環(huán)進行整體轉(zhuǎn)錄和翻譯，獲得每個蛋白質(zhì)微米環(huán)的單獨基因編碼，利用融合蛋白技術(shù)，構(gòu)建出具有多種結(jié)構(gòu)域的目的蛋白，提取蛋白質(zhì)序列特征，將蛋白質(zhì)序列表示形式轉(zhuǎn)化為數(shù)值，獲取區(qū)別于其他蛋白質(zhì)序列的明顯特征，從而獲取蛋白質(zhì)單類特征信息，反映蛋白質(zhì)微米環(huán)的形貌特征.

在以上理念的基礎(chǔ)上，本研究利用激光共聚焦顯微鏡，對蛋白質(zhì)微米環(huán)形貌進一步研究.激光共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上，使用可見光激發(fā)熒光探針，并利用計算機進行圖像處理，實現(xiàn)斷層掃描成像，得到蛋白質(zhì)微米環(huán)形貌的熒光圖像，進而分析蛋白質(zhì)微米環(huán)的空間結(jié)構(gòu)，確保序列特征描述得清晰完整.

1 資料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

主要試劑：99% 碘化鉀、蛋白質(zhì)純化試劑、99%生物素、DMEM 蛋白質(zhì)培養(yǎng)基、99%碳酸鉀和碘化鉀、胰蛋白質(zhì)酶液、二羥基苯甲酸甲酯、20%乙醇等.

實驗設(shè)備：HW1 型電熱恒溫水浴箱、XH-89型漩渦振蕩器、JA1003 型電子精密天平、400e型普通離心機、828 型pH 計、Smartspec 3000 型可見光分光光度計、Olympus 倒置熒光顯微鏡、FLAsH 型小分子熒光探針、JA1003 型激光共聚焦顯微鏡.

1.2 構(gòu)建融合蛋白質(zhì)原核表達載體

選取PCRT7/VP22-2-TOPO 綠色熒光蛋白質(zhì)試劑進行反應(yīng)融合，構(gòu)建融合蛋白質(zhì)原核表達載體，利用下列引物擴增蛋白質(zhì)微米環(huán)的全長序列.首先將表達載體分為上游引物和下游引物，建立50 μL 的PCR 反應(yīng)體系［4］.如表1 所示.

以PCR 反應(yīng)體系為模板，利用電泳儀、配套電泳槽、凝膠滲透色譜及分子體積排除色譜，并選取rTaq 聚合酶，擴增蛋白質(zhì)微米環(huán)片段［5］.其反應(yīng)條件如表2 所示.

表1 PCR 反應(yīng)體系

表2 PCR 反應(yīng)條件

滿足上表所示的實驗環(huán)境，使綠色熒光蛋白質(zhì)在PCR 體系中產(chǎn)生反應(yīng)，進行Step1 之后，循 環(huán)Step2 到Step430 次，直 至Step5 結(jié) 束反應(yīng)，得到綠色熒光融合蛋白質(zhì)表達載體［6］.然后將50 mmol/L Tris-HCl 作為緩沖溶液，當(dāng)融合蛋白質(zhì)分子量為流動相時，選取DMSO-d6為溶劑，在25 ℃條件下滴定溶劑、緩沖溶液與融合蛋白質(zhì)，溶劑選取1～2 μL，對融合蛋白質(zhì)表達載體進行凝膠電泳［7］.

1.3 優(yōu)化融合蛋白質(zhì)表達條件

獲得融合蛋白質(zhì)的微米環(huán)表達載體后，改變?nèi)诤系鞍踪|(zhì)濃度，對蛋白質(zhì)微米環(huán)的表達條件進行優(yōu)化.根據(jù)融合蛋白質(zhì)分子量的大小選取濃度為10%的凝膠，按照所需各試劑比例對凝膠進行配制［8］.然后對融合蛋白質(zhì)進行純化，保證純化柱底端密封，將融合蛋白質(zhì)的移液管顛倒振蕩，加入6 mL 凝膠和10 mL 無菌去離子水，使綠色熒光融合蛋白質(zhì)自然沉降，再向純化柱中注入1.5 mL 樹脂，吸出上清液，用20%乙醇做純化柱的液封［9］.加強純化后的融合蛋白質(zhì)熒光效應(yīng)，在純化柱中加入8 mL 二羥基苯甲酸甲酯，使融合蛋白質(zhì)與二羥基苯甲酸甲酯結(jié)合45 min，然后使二羥基苯甲酸甲酯從純化柱低端流出，再選取8 mL 99%碳酸鉀和碘化鉀洗柱，讓洗液從純化柱低端流出［10］.重復(fù)上述過程3 次，最后豎直放置融合蛋白質(zhì)的純化柱，接收流出的綠色熒光融合蛋白質(zhì)［11］.采用Bradford 對純化后的蛋白質(zhì)濃度進行測定，VP22 融合蛋白質(zhì)純度如表3 所示.

表3 融合蛋白質(zhì)濃度的測定結(jié)果

根據(jù)蛋白質(zhì)濃度，測得7 種蛋白質(zhì)的綠色熒光吸收值，其吸收值分別為0.1578、0.4740、0.3364、0.3178、0.2225、0.5877、0.5084，以此判斷加強后的融合蛋白質(zhì)熒光效應(yīng)，能夠滿足實驗條件.

1.4 基于激光共聚焦顯微鏡表征融合蛋白質(zhì)微米環(huán)

在融合蛋白質(zhì)表達條件優(yōu)化完畢的基礎(chǔ)上，利用激光共聚焦顯微鏡誘導(dǎo)蛋白質(zhì)原核表達載體的微米環(huán)表達，表征綠色熒光蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài).在25 °C 條件下，對熒光融合蛋白質(zhì)進行兩步酯化反應(yīng)，利用凝膠滲透色譜，在室溫下測定蛋白質(zhì)聚集狀態(tài)及分子量，使滴定配體與熒光融合蛋白質(zhì)相互作用，得到微米環(huán)配體結(jié)構(gòu)［12］.利用JA1003 型激光共聚焦顯微鏡表征蛋白質(zhì)微米環(huán)的形貌，發(fā)現(xiàn)融合蛋白質(zhì)微米級的環(huán)狀組裝體，其寬度較為均一，具體如圖1 所示.

圖1 激光共聚焦顯微鏡下的微米環(huán)

由圖1 可知，微米環(huán)寬度約為30 nm.再利用激光共聚焦顯微鏡，對熒光融合蛋白質(zhì)的溶液進行表征，效果如圖2 所示：

圖2 融合蛋白質(zhì)熒光微米環(huán)

該熒光微米環(huán)分別在488 nm 和561 nm 激光器下穩(wěn)定發(fā)光，判斷488 nm 和561 nm 波長特征，可得兩個波長分別為熒光融合蛋白質(zhì)的激發(fā)波長和羅丹明B 的激發(fā)波長.由此可得，融合蛋白質(zhì)微米環(huán)經(jīng)過兩步酯化反應(yīng)后，兩端分別合成生物素和羅丹明B，且中間具有3個重復(fù)單元的配體Rh4Bio，如圖3 所示：

圖3 蛋白質(zhì)微米環(huán)配體結(jié)構(gòu)

探討微米環(huán)配體結(jié)構(gòu)的合成路線，控制生物素密度為60%～70%，在45 ℃和5% CO2的實驗條件下，加入熒光融合蛋白質(zhì)到濃度2 μM，1 h 后將舊培養(yǎng)基換成新鮮無血清培養(yǎng)基，利用激光共聚焦顯微鏡進行觀察拍照［13］.再對融合蛋白質(zhì)進行洗滌，置于圓底燒瓶中冰浴2 h，利用99%碘化鉀溶液洗滌反應(yīng)體系，最后攪拌蛋白質(zhì)溶液恢復(fù)至室溫，經(jīng)干燥過濾后，通過經(jīng)濕法濃縮溶液，得到紫紅色泡狀固體，分析其成分可知，微米環(huán)配體是由烷氧鏈連接而成的.

1.5 計算融合蛋白質(zhì)微米環(huán)分子量

完成微米環(huán)形貌表征和配體結(jié)構(gòu)的觀察后，還要獲取微米環(huán)出峰位置和聚集位置，計算微米環(huán)分子量.參考已發(fā)表的相關(guān)序列信息，對蛋白質(zhì)微米環(huán)表達載體進行雙酶切處理，連接微米環(huán)的生物素和羅丹明B，再通過凝膠回收雙酶切產(chǎn)物，將微米環(huán)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài).當(dāng)熒光融合蛋白質(zhì)經(jīng)測序檢驗正確后，將DH5α 感受態(tài)轉(zhuǎn)化為BL21 感受態(tài)，采用5 mL 的Ni-NTA 親和層析柱，得到無標(biāo)簽的熒光融合蛋白，將最終產(chǎn)物保存在胰蛋白質(zhì)酶液中，對微米環(huán)進行大規(guī)模誘導(dǎo)表達，從而收集出峰位置的洗脫樣品.微米環(huán)的出峰位置只存在一個特定區(qū)域，其融合蛋白質(zhì)的結(jié)合分子摩爾數(shù)v為：

式中：ni為第i區(qū)域上的結(jié)合位點數(shù)，L為游離的融合蛋白質(zhì)小分子濃度，m為融合蛋白質(zhì)大分子中可供小分子結(jié)合的區(qū)域總數(shù)，Ki為第i區(qū)域上的結(jié)合常數(shù)［14］.假設(shè)融合蛋白質(zhì)出峰位置處的小分子與大分子的結(jié)合只存在一個特定區(qū)域，對公式（1）進行簡化，獲取相關(guān)結(jié)合參數(shù)，可以得出以下結(jié)論：當(dāng)出峰位置的融合蛋白質(zhì)發(fā)生1∶1 結(jié)合，公式（1）的計算結(jié)果為擬合直線；當(dāng)曲線存在轉(zhuǎn)折，則出峰位置存在多種獨立位點.則出峰位置結(jié)合的小分子數(shù)目r為：

式中：L1、L2分別為不同蛋白質(zhì)濃度下加入的小分子濃度，P1、P2分別為不同的熒光融合蛋白質(zhì)總濃度.利用蛋白質(zhì)濃度的等溫結(jié)合曲線，擬合結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合常數(shù)，可得融合蛋白質(zhì)微米環(huán)的分子量M為：

式中：H為不同融合蛋白質(zhì)濃度比下的熒光強度，l為小分子與融合蛋白質(zhì)的濃度總和，Q為融合蛋白質(zhì)自由大分子的熒光強度，其中Q為定值，為熒光值最大對應(yīng)的大分子摩爾比與融合蛋白質(zhì)分子摩爾比的比值［15］.由此計算出熒光融合蛋白質(zhì)微米環(huán)在出峰位置和聚集位置的分子量，判斷微米環(huán)的形貌狀態(tài).

2 實驗結(jié)果

利用蛋白質(zhì)原核表達載體，表達出含MBP標(biāo)簽的綠色熒光融合蛋白質(zhì)，再切除MBP 標(biāo)簽，得到無標(biāo)簽的綠色熒光融合蛋白質(zhì)，通過MBP 值表示微米環(huán)熒光強度的大小.結(jié)果可得，PCR 擴增后的融合蛋白質(zhì)微米環(huán)的擴增產(chǎn)物中具有明顯可見條帶，如圖4 所示.

圖4 融合蛋白質(zhì)微米環(huán)的產(chǎn)物電泳圖

由圖4 顯示的電泳結(jié)果可知，綠色熒光融合蛋白質(zhì)的分子量約105 kDa，其分子量大小與理論相符，可以判斷熒光融合蛋白純度可達90%，能夠保留蛋白質(zhì)單類特征信息.使用高分辨率凝膠過濾層析，初步處理純化后的綠色熒光融合蛋白質(zhì)，微米環(huán)分子量及理論分子量如圖5 所示.

圖5 蛋白質(zhì)微米環(huán)的單峰狀態(tài)

由圖5 可知，融合蛋白質(zhì)微米環(huán)單峰狀態(tài)的出峰位置為16.9 mL，同樣與理論值相符，21.3 mL 時同樣存在凸起，由于該狀態(tài)下的分子量較小，可以判斷凸起位置為MBP 標(biāo)簽，且微米環(huán)熒光強度超過600.結(jié)合微米環(huán)產(chǎn)物電泳圖和MALDI-TOF 質(zhì)譜驗證可得，初步處理純化后的融合蛋白質(zhì)中微米環(huán)分子量為67 kDa左右，選取出峰位置的微米環(huán)分子量進行檢測，結(jié)果如圖6 所示.

圖6 微米環(huán)出峰位置的分子量

由圖6 可知，初步處理純化后的融合蛋白質(zhì)微米環(huán)呈單峰狀態(tài)，其出峰位置分子量與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量相差不大，使熒光融合蛋白質(zhì)在溶液中以二聚體形式存在，利用圖4 所示的凝膠電容，檢測微米環(huán)呈聚集狀態(tài)時的分子量，結(jié)果如圖7 所示.

圖7 蛋白質(zhì)微米環(huán)的聚集狀態(tài)

由圖7 可知，融合蛋白質(zhì)微米環(huán)聚集位置為15.4 mL，和出峰位置相差不大.聚集位置分子量如圖8 所示.

圖8 微米環(huán)聚集位置的分子量

由圖8 可知，微米環(huán)聚集狀態(tài)的分子量約為93 kDa，其分子量同樣與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量相差不大.綜上所述，融合蛋白質(zhì)微米環(huán)的分子量與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量接近，其粒徑尺寸幾乎沒有變化.

3 討論

在不同濃度誘導(dǎo)劑的條件下，測試綠色熒光融合蛋白質(zhì)微米環(huán)的單峰狀態(tài)和聚集狀態(tài)，檢測不同狀態(tài)下的分子量，并與理論值進行對比發(fā)現(xiàn)，融合蛋白質(zhì)粒徑尺寸變化不大，形貌規(guī)整且具有較強的熒光.綠色熒光融合蛋白質(zhì)具有2個生物素結(jié)合位點，分別為生物素和羅丹明B 分子，融合蛋白質(zhì)微米環(huán)純度達98%以上，結(jié)合常數(shù)與生物素的結(jié)合能力相吻合.微米環(huán)配體結(jié)構(gòu)中，羅丹明B 為二聚化結(jié)構(gòu)，結(jié)合生物素的特異性，使熒光融合蛋白質(zhì)與配體Rh4Bio 自組裝，利用配體分子參與蛋白質(zhì)的雙重非共價作用，形成自組裝的蛋白質(zhì)微米環(huán).純化后的融合蛋白質(zhì)微米環(huán)的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力有所提高，通過微米環(huán)分子量的凝膠電泳結(jié)果可知，其微米環(huán)沒有任何表達.微米環(huán)形貌變化不大，寬度一直保持30 nm 左右，配體分子僅有1個生物素分子、一個羅丹明B 分子及3個重復(fù)單元的配體Rh4Bio.

綠色熒光蛋白質(zhì)為四聚體，融合蛋白質(zhì)微米環(huán)的溶液則以二聚體形式存在，表明融合蛋白質(zhì)微米環(huán)也是二聚體.微米環(huán)配體中的生物素分子以“肩并肩”的形態(tài)排列，生物素與羅丹明B 分子間連接的多肽鏈通過配體Rh4Bio 的二聚化，具有了一定的柔性，使綠色熒光蛋白質(zhì)形成更高級的組裝，與其他綠色熒光蛋白質(zhì)進行特異性結(jié)合，從而形成蛋白質(zhì)微米環(huán).相比于綠色熒光蛋白質(zhì)的桶狀結(jié)構(gòu)，微米環(huán)在組裝過程中會產(chǎn)生曲率變化，比桶狀結(jié)構(gòu)更大，形成納米線狀結(jié)構(gòu).電泳結(jié)果顯示分子量都超過50 kDa，可知部分綠色熒光蛋白質(zhì)融合過程中，微米環(huán)遷移率存在異常，N 端堿性結(jié)構(gòu)域中存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，與微米環(huán)配體分子進行二聚化，形成最終的納米線狀結(jié)構(gòu).

4 結(jié)語

此次研究通過組裝綠色熒光蛋白質(zhì)與配體分子，形成融合蛋白質(zhì)微米環(huán)，并利用激光共聚焦顯微鏡對其進行了深入分析，但此次研究只在混合條件下對純化后的熒光融合蛋白質(zhì)進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，在今后的研究中會對比多種條件，使綠色熒光融合蛋白質(zhì)達到理想濃度，進而提高蛋白質(zhì)微米環(huán)的純度.