裙帶菜多糖的堿提取工藝研究

車環宇，郝鑫龍

裙帶菜（Undaria pinnatifida，Wakame），褐藻門、褐子綱、海帶目、翅藻科、裙帶菜屬［1］.近年的研究表明，裙帶菜多糖在抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、促進免疫等方面顯示出獨特的生物活性，其研究越來越受到人們的關注［2］.常用的裙帶菜多糖提取方法有復合酶解法、熱水浸提法、超聲波提取法和堿提取法［3］.本實驗采用堿提取法提取裙帶菜多糖，并利用紫外可見分光光度法進行定性定量分析，這種方法簡便，易于操作，且回收方便，回收率較高，在普通的實驗室就可進行.測定結果可靠穩定.本實驗以裙帶菜為原料，對堿提取法的工藝進行了研究，為今后深入研究奠定了初步的基礎.

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外-可見分光光度計：UV-2102C 型，上海尤尼柯儀器有限責任公司；電子天平：AY120 型，日本島津公司；電子恒溫水浴鍋：HH-2 型，天津市泰斯特儀器有限公司；循環水式多用真空泵：SHB-B95 型，鄭州長城科工貿有限公司；電熱鼓風干燥箱：101-1AB 型，天津市泰斯特儀器有限公司；量筒、試管、燒杯、漏斗、濾紙、玻璃棒、布氏漏斗、容量瓶、移液管、鐵架臺（鐵環和鐵夾）、膠頭滴管、濾紙.

1.2 試藥

裙帶菜干粉購自大連；無水葡萄糖（天津市天達凈化材料精細化工廠）；無水碳酸鈉（上海化學試劑有限公司）；95%乙醇（天津化學試劑有限公司）；苯酚（中國上海試劑總廠）；濃硫酸（哈爾濱市化工試劑廠）；稀鹽酸（哈爾濱新春化工產品有限公司）；蒸餾水.

2 實驗方法

2.1 堿提取裙帶菜中多糖的工藝研究

（1）堿提取工藝.取裙帶菜干粉，按一定料液比加入1% Na2CO3溶液，恒溫水浴提取，3000 r/min 離心10 min，取上清液，加稀鹽酸攪拌至pH 2.0，析出凝膠，用95%乙醇洗滌脫水，得棕色粉末，干燥至恒重，精密稱重，計算得率.

（2）單因素試驗和正交試驗.溫度選用50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃五個水平；提取時間選用2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 五個水平；料液比選用1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 五個水平.根據單因素試驗結果，采用L9（34）設計正交試驗，篩選最佳提取工藝.

（3）多糖含量測定.①制備標準曲線.精密稱取約105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖100.0 mg，置于100 mL 容量瓶中加蒸餾水溶解并定容，搖勻，獲得對照品溶液備用.分別吸取上述溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，置于100 mL 容量瓶加蒸餾水定容，得0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL 的6個 不 同 濃 度 的 對照品溶液. 精密吸取上述溶液各1 mL 置于10 mL 的試管中，用蒸餾水分別補至2 mL，加入苯酚1 mL 混勻，再迅速滴加5 mL 濃硫酸，混勻，置于50 ℃水浴中30 min，取出放置室溫，以蒸餾水同法操作為空白，在489 nm 處測定吸收度.②樣品溶液的制備.取粗多糖干品100.0 mg，用蒸餾水定容于100 mL 容量瓶，從中吸取10 mL 于50 mL 的容量瓶中定容.③裙帶菜多糖得率測定.吸取1 mL 裙帶菜多糖水溶液于試管中，按標準曲線制備步驟操作，測其吸光度，以標準曲線計算多糖含量.

2.2 實驗結果計算

多糖含量計算公式為：w=cFV/m×100%，式中：w為多糖樣品含量，%；c為溶液濃度，μg/mL；F為溶液的稀釋倍數；V為溶液體積，mL；m為稱取的樣品質量，mg.

（1）標準曲線的制備.以吸光度（A）為縱坐標，標準品濃度（C）為橫坐標，得標準曲線.經回歸處理的線性回歸方程：Y=2.7858X+0.1262，R2=0.9947，X為在Y吸光度下根據回歸方程計算所得的值.結果見圖1.

圖1 標準曲線

（2）單因素試驗.①提取溫度對多糖提取率的影響.保持提取時間2 h，料液比1∶60，Na2CO3溶液濃度1%，提取溫度分別為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃條件下提取裙帶菜多糖.②提取時間對多糖提取率的影響.保持提取溫度60 ℃，料液比1∶60，Na2CO3溶液濃度1%，提取時間分別為2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 條件下提取裙帶菜多糖.③料液比對多糖提取率的影響.保持提取溫度60 ℃，提取時間2 h，Na2CO3溶液濃度1%，料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 條件下提取裙帶菜多糖.

（3）堿提取裙帶菜多糖的正交試驗.根據單因素實驗，用L9（34）正交實驗考察提取時間、提取溫度和料液比對褐藻酸提取率的影響.

2.3 實驗方法學考察

（1）精密度試驗.精密稱取適量裙帶菜多糖，用蒸餾水定容，按照操作步驟測定5 次.

（2）穩定性試驗.取樣品溶液，分別在0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h 內對其吸光度進行測定.

（3）重復性試驗.取相同質量裙帶菜粉末5 份，按樣品含量測定方法進行測定.

（4）回收率試驗.精密稱取裙帶菜多糖樣品，共5 份，每份1 mg，分別加入無水葡萄糖1 mg，按樣品的含量測定方法進行測定.

3 實驗結果

3.1 單因素試驗

（1）提取溫度對多糖提取率的影響.保持提取時間2 h，料液比1∶60，Na2CO3溶液濃度1%，提取溫度分別為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃條件下提取裙帶菜多糖，結果見表1.

表1 提取溫度對多糖提取率的影響

從表1 可以看出，當提取溫度達到70 ℃時得率達到最高值，超過70 ℃提取率下降.因此選擇溫度60 ℃、70 ℃、80 ℃三個水平進行正交試驗.

（2）提取時間對多糖提取率的影響.保持提取溫度60 ℃，料液比1∶60，Na2CO3溶液濃度1%，提取時間分別為2 h、4 h、6 h、8 h、10 h條件下提取裙帶菜多糖，結果見表2.

表2 提取時間對多糖提取率的影響

從表2 可以看出，提取時間為8 h 時，多糖得率最高，此后下降.因此選擇提取時間6 h、8 h、10 h 三個水平進行正交試驗.

（3）料液比對多糖提取率的影響.保持提取溫度60 ℃，提取時間2 h，Na2CO3溶液濃度1%，料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70條件下提取裙帶菜多糖，結果見表3.

表3 料液比對多糖提取率的影響

由表3 可以看出，隨著提取溶劑的增加，裙帶菜多糖提取率先升后降，料液比為1∶50時得率最高.因此，選擇料液比1∶40、1∶50、1∶60 三個水平進行正交試驗.

3.2 堿提取裙帶菜多糖的正交試驗

根據單因素實驗，用L9（34）正交實驗考察提取時間、提取溫度和料液比對褐藻酸提取率的影響.因素水平設置見表4，正交實驗結果見表5，方差分析見表6.

表4 因素水平表

表5 正交試驗結果

表6 方差分析表

由正交試驗表可知，A2B2C3 為提取裙帶菜多糖的最佳工藝組合，即提取溫度70 ℃，提取時間8 h，料液比1∶60.極差分析R值表明，各因素影響裙帶菜多糖得率效果的主次順序為提取溫度＞提取時間＞料液比，提取溫度對多糖得率的影響最大.

3.3 實驗方法學考察

（1）精密度試驗.精密稱取適量裙帶菜多糖，用蒸餾水定容，按照操作步驟測定5 次，測定結果的RSD 為0.20%，說明該方法的精密度較高.結果見表7.

表7 精密度試驗考察結果

（2）穩定性試驗.取樣品溶液，分別在0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h 內對其吸光度進行測定，測定結果的RSD 達到0.45%，表明裙帶菜多糖的水溶液至少在2 h 內穩定.結果見表8.

表8 穩定性試驗考察結果

（3）重復性試驗.取相同質量的裙帶菜粉末5 份，按樣品含量測定方法進行測定，測定結果的RSD 達到0.50%，表明實驗的重復性較好.結果見表9.

表9 重復性試驗考察結果

（4）回收率試驗.精密稱取裙帶菜多糖樣品5 份，每份1 mg，分別加入無水葡萄糖1 mg，按樣品的含量測定方法進行測定，平均回收率為99.2%.結果見表10.

表10 回收率試驗考察結果

4 討論與結論

4.1 討論

本實驗所用的儀器、試驗方法以及結果和以往裙帶菜多糖的提取相比較，能節省時間，有效提升提取率，實驗過程順利，測定結果可靠穩定，為今后深入研究奠定了基礎.但是在對提取物進行離心時發現，由于裙帶菜經過水浴加熱后過于粘稠，無法順利得到上清液，沉淀部分仍有可分離的提取溶液，容易造成浪費.因此，在以后的相關實驗中，應考慮采用何種方法能夠降低裙帶菜多糖提取溶液的粘度，以便在大規模工業化生產中能夠最大限度地利用裙帶菜原料提取多糖.在制備標準品溶液和樣品含量測定時，需用到苯酚溶液和濃硫酸溶液.由于苯酚極易被氧化，因此需現配現用.如果苯酚晶體已接觸空氣，須重蒸苯酚，得到182 ℃的餾分，再配成6%的溶液.苯酚-硫酸法顯色后要盡快測定，以免長時間放置，吸光度有所變化，影響實驗結果.

4.2 結論

本實驗使用紫外分光光度法對裙帶菜中褐藻膠進行定性定量分析，最大吸收波長為489 nm.不同提取條件下提取出來的裙帶菜多糖含量相差較大.本文探討了與堿提取法作用相關的提取時間、提取溫度和料液比因素對多糖提取率的影響，同時采用正交試驗確立最佳條件.正交優化條件為：在提取時間為8 h、提取溫度為70 ℃、料液比為1∶60 的條件下，所提取的裙帶菜多糖含量最高.堿提取裙帶菜多糖的方法簡便，易于操作，是今后常用的裙帶菜多糖提取方法之一.通過方法學考察可知，本實驗所采用的方法穩定可靠，具有較好的精確度、穩定性、重現性和準確性，可用于裙帶菜多糖提取的含量測定.