一例豬流行性腹瀉的RT-PCR診斷

何國榮

(黃山區動物疫病預防與控制中心，安徽 黃山 245700)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種急性、高度接觸性以急性腸炎及水樣腹瀉為主要特征的傳染病[1]。本病于1978年首次報道于比利時和英國，此后在歐洲和亞洲等多個國家相繼發生，給養豬業造成了較大的經濟損失[2]。豬只感染豬流行性腹瀉通常發病突然，傳播速度較快，病程較長，臨床治療使用抗生素無效。該病發病率高，哺乳仔豬死亡率也很高。

PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬的成員，基因組為線形單股正鏈長27～33 kb的RNA病毒[3]。M蛋白是一種跨膜蛋白，在病毒粒子的組裝和出芽過程中具有重要作用，同時也是病毒刺激機體產生免疫保護的重要結構蛋白，其抗原表位在疫苗的研發和新型檢測方法的建立中具有極大的應用前景[4]。2017年5月安徽巢湖某豬場暴發疑似豬流行性腹瀉，筆者以PEDVM基因片段為引物，采取反轉錄-聚合酶鏈式反應技術(RT-PCR)進行診斷，現將診斷結果報道如下，以期為該病的早期診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

病料：取安徽巢湖某豬場一發病豬的淋巴組織。試劑：rTaq DNA聚合酶購自TaKaRa公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、病毒基因組DNA/ RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 病料的采集與研磨 2017年5月安徽巢湖某豬場暴發疫病，架子豬及成年豬表現為水樣腹瀉，死亡率不高，發病哺乳仔豬表現為伴有脫水的水樣腹瀉且死亡率達85%以上，初步判斷該豬場疫病為豬流行性腹瀉，收集病死的哺乳仔豬淋巴結經處理后放在-80℃冰箱待用。

1.2.2 RNA的提取與RT-PCR 按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書提取病毒RNA。取10 μL提取的RNA于50 μL反應體系進行反轉錄反應，獲取cDNA。反應體系：DEPC 水10 μL，M-MLV 反轉錄酶 2 μL，5×M-MLV Buffer 10 μL，dNTPs(10 mmol/L) 3 μL，Rnase Inhibitor 1μL，RNA 20 μL，隨機引物4 μL。于42℃水浴鍋中孵育1 h后于70℃作用15 min。獲取的cDNA保存于-80℃待用。

1.2.3 PEDVM基因的PCR擴增 對PEDVM基因進行PCR擴增，PCR體系：rTaq DNA聚合酶Mix 10 μL，PEDV cDNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，補加滅菌ddH2O至20 μL。擴增條件：95℃ 5 min；94℃ 50 s，54℃ 1 min，72℃ 50 s，35個循環；72℃ 10 min。將PCR產物根據天根生化科技有限公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒步驟，回收與純化產物，送至上海擎科生物有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 病豬的臨床癥狀

發病豬場母豬存欄300余頭，先有零星母豬表現出水樣腹瀉，后擴散至哺乳仔豬及育肥豬，初期仔豬出現體溫降低、水樣腹瀉、嘔吐、脫水、扎堆，隨著病程延長，食欲下降，消瘦，最后導致脫水和代謝紊亂衰竭而亡，發病仔豬死亡率達85%以上。育肥豬及母豬體溫正?；蛏缘停股刂委煙o效，個別豬只急性發病死亡，死亡率低。

2.2 PEDV M基因的擴增與測序結果

經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約689 bp左右特異性條帶，與PEDVM目的基因相符(圖1)。測序結果經BLAST比對確認為PEDVM基因，確診該豬場發生豬流行性腹瀉。

3 結論與討論

PED的流行對世界養豬業影響較大，2010年冬季至2011年春季，我國部分規?；B豬場發生該病，且用抗生素治療均未取得明顯效果，對我國養豬業造成了嚴重的經濟損失。近年來，豬流行性腹瀉病毒的發生率呈上升趨勢，給養豬業造成的損失加大[5]。PEDV可引發仔豬腹瀉性疾病，生長發育嚴重受阻，存活率、飼料轉化率、日增重等降低，最后衰竭而死；成年豬的臨床癥狀表現不一，但普遍表現厭食，嚴重時出現腹瀉；泌乳母豬的臨床癥狀與仔豬較為相似，嚴重時泌乳停止，通過垂直途徑傳染仔豬，這也是造成仔豬死亡率高的另一個重要原因[6]。

通過RT-PCR方法對豬場疑似豬流行性腹瀉進行診斷，經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約689 bp的特異性條帶，經測序鑒定，確認為PEDVM基因，由此確定該豬場發生的疫病為豬流行性腹瀉。該方法具有特異、敏感、快速簡便等優點，可有效地檢測出樣品中的PEDV病原。測序結果有利于增加對豬流行性腹瀉M基因進化情況的理解，為PED的早期診斷提供了有效的方法，并為安徽地區PEDV的分子流行病學調查奠定了一定的基礎數據。