不同產地川芎UPLC指紋圖譜研究

劉尹 郭倫鋒 鄭龍

(安康市中心醫院藥劑科，陜西 安康 725000)

川芎(LigusticumchuanxiongHort.)是傘形科藁本屬多年草本植物干燥的根莖[1]，主要生長在四川的彭州和都江堰等地區的道地藥材。川芎性溫，味辛；歸肝、心、膽經，最早記載于《神農本草經》，川芎是祛風止痛、活血行氣的良藥，川芎主要藥效成分包括阿魏酸、總生物堿、揮發油和酚性成分等物質[2-3]。現代藥理學研究[4-5]表明，川芎具有擴張冠脈血管，延緩外周動脈血管緊張，改善腦部部位循環，保護腦缺血損傷，抑制血小板聚集及抗血栓形成，抗氧化等藥理作用。指紋圖譜分析是對中藥或天然藥物質量的一種整體表達方式，能客觀的體現中藥的復雜性和整體性[6-7]。本實驗所建立的UPLC指紋圖譜鑒別方法，可操作性強，簡單，專屬性強，為有效、客觀的評價川芎藥材質量提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 (1)儀器：島津LC-20ADXR型高效液相色譜儀，配備包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器(PDA)(島津公司)；KQ-300DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BP210S電子天平(德國Sartorius公司)。(2)試劑：阿魏酸(批號為110807-201306，質量分數為99.0%)，洋川芎內脂Ⅰ(批號為150213，質量分數為98.0%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；蒿本內酯(批號為MUST-11072416，質量分數為99.0%)，購自成都曼斯特生物科技有限公司；實驗用甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其余試劑為分析純。15批川芎藥材來源于四川成都、彭山、湖北、浙江、云南等地，藥材處理方法按照2015版藥典要求切片，曬干，粉碎，過4號篩，備用。

1.2方法

1.2.1色譜條件 Accucore TC-C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱；流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫，梯度程序為：0 min：5% A，2 min：10% A，25 min：40% A，30 min：60% A，35 min：90% A，45 min：5% A，檢測波長280 nm；流速0.2 mL/min；進樣量2 μL；柱溫35°C。

1.2.2對照品溶液的制備 取阿魏酸、洋川芎內脂Ⅰ、蒿本內酯對照品適量，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，加入70%甲醇，搖勻制成混合對照品溶液。

1.2.3供試品溶液制備 取川芎粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精

密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2 結 果

2.1系統適用性試驗 將空白試劑(甲醇)、混合對照品溶液、供試品溶液，按“1.2.1項下”的色譜條件分別進樣分析。對比三個色譜圖，如圖1所示。結果顯示各成分相互之間均無明顯干擾，分離度符合測定要求，且空白試劑也無干擾峰存在。

注：1.阿魏酸；2.洋川芎內脂I；3.蒿本內酯圖1 空白溶液、混標、供試品UPLC色譜圖

2.2精密度試驗 將同一種供試品溶液，按“1.2.1項下”的色譜條件連續進樣6次，每次進樣2 μL，測定主要色譜峰的峰面積分值。計算參考峰面積RSD值，各共有峰相對保留時間的RSD值為0.56%～2.57%，表明精密度良好。

2.3穩定性試驗 取同一批供試品溶液，按“1.2.1項下”的色譜條件，分別于制備后的0、2、4、8、12、24 h進樣，進樣量2 μL，測定主要色譜峰的峰面積分值。計算參考峰面積RSD值，各共有峰相對保留時間的RSD值為0.83%～1.24%。表明混合對照品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4重復性考察 按照“1.2.3項下”供試品溶液制備的方法平行制備6份供試品溶液，分別按上述色譜條件，進樣量2 μL，測定主要色譜峰的峰面積分值。計算參考峰面積RSD值，各共有峰相對保留時間的RSD值為1.55%～3.73%，表明該方法的重復性較好。

2.5指紋圖譜的建立 按“1.2.3項下”供試品制備方法制備15個不同產地川芎藥材的供試品溶液，取供試品溶液各進樣2 μL，以阿魏酸峰(2號)為參照物峰，理論板數不低于8 000。按“1.2.1”項下色譜條件分別測定，將15批樣品測定數據以AIA格式導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2004A)，采用相對保留時間作為唯一指標，利用中位數法，時間窗寬度設置值為0.1，多點校正后進行峰自動匹配，計算生成對照譜圖R，生成的對照圖譜和峰自動匹配后所有樣品的UPLC指紋圖譜如圖2所示，再進行共有峰標定，最終標定了共有峰15個，編號為 S1～S15。 各特征峰相對穩定，具有指紋圖譜特征性。以2號峰(阿魏酸)作為參照峰，標定15個共有峰的相對保留時間，結果顯示各共有峰相對保留時間 RSD 在0.03%～0.68%，經混合對照品溶液譜圖對比，確認了3個主要特征峰，分別是2號峰(阿魏酸)，3號峰(洋川芎內脂I)；11號峰(蒿本內酯)。

注：S1-S15.15批樣品UPLC圖；R.對照色譜圖；2.阿魏酸；3.洋川芎內脂I；11.蒿本內酯圖2 15批川芎樣品色譜分析圖

2.6川芎指紋圖譜的評價 依照指紋圖譜整體性、相似性的特征，對生成的指紋圖譜進行指標評價，對15批不同產地川芎的指紋圖譜(S1～S15)進行系統評價。結果，檢測的相似度值均高于0.957，川芎藥材相似度評價結果見表1。

表1 15批川芎藥材相似度評價結果

2.73個指標成分峰面積值分析 以樣品編號為橫坐標，以阿魏酸、洋川芎內脂Ⅰ、蒿本內酯3 個峰總峰面積值為縱坐標，得出 15 批川芎 3 個共有峰總峰面積值曲線圖，如圖3所示。結果表明云南、四川、浙江產地的(S4～S8) 3個共有峰峰面積總值在所有樣品中最大，總體含量最高，而彭山、漢中、成都(S9～S15)3個共有峰峰面積總值最小，總體含量最低，其中彭州、彭山、成都(S1～S3、S9～S11、S13～S15)三個產地組的組內的三個藥材的3個共有峰峰面積接近，總體含量接近，同時表明來源于同一產地的川芎中的成分含量相近。綜合含量分析結果可知，同產于四川的川芎，含量也有較為明顯的差異，表明產地對川芎質量影響較大。

圖3 15批川芎阿魏酸、洋川芎內脂Ⅰ、蒿本內酯總峰面積值曲線圖

3 討 論

本實驗以PAD檢測器對不同的川芎樣品進行全波長掃描發現，大部分共有峰成分在280 nm波長下有較好吸收，且基線平穩，峰高度較好，峰形較佳，因此確定280 nm為指紋圖譜檢測波長。試驗考察了甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、分別作為流動相系統，最終選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動相梯度洗脫，各色譜峰的峰形較好，能達到基線分離。考察了1、2、4、5 μL等不同樣品進樣量，考察25°C、30°C、35°C、等不同柱溫，以及0.1 mL/min、0.2 mL/min、0.3 mL/min、0.5 mL/min等不同流速。綜合考慮其他目標峰的情況，最終選定的檢測條件為：乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫，檢測波長280 nm，流速0.2 mL/min，進樣量2μL，柱溫35°C為較適宜色譜條件。對比超聲法和加熱回流法提取下的色譜圖，確定“1.2.3”項下的提取方法。

目前，在現有的文獻報道中大多采用對川芎有效成分含量測定，片面的以含量的高低，進行川芎質量評價，但這種單一的方式難以反映中藥整體質量[8]。本實驗所建立川芎檢測和分析方法可以有效的評價藥材內在品質和差異性，同時又能為含量檢測方法提供一定的支撐，綜合結果表明本研究建立的川芎指紋圖譜重復性好，方法可行，可作為質量評價的方法。