間充質干細胞對人凍融卵巢組織移植后低氧期保護作用的研究進展

程姣姣 阮祥燕 杜 娟 谷牧青

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院內分泌科，北京 100026)

世界衛生組織(World Health Organization，WHO)[1]數據顯示，中國2018年新發癌癥患者達428.5萬例。隨著腫瘤治療學的進步，癌癥患者的生存率有了極大提高。與此同時，年輕癌癥患者在臨床痊愈后對生育要求也越來越迫切，78.3%～90.0%的年輕癌癥患者有生育及再生育的強烈需求[2]。放射治療(以下簡稱放療)和細胞毒類抗癌藥物的應用在挽救癌癥患者生命的同時，難以避免地造成卵巢功能不可逆的損傷[3]。接受10～15 Gy照射劑量的青春期前女孩未來發生早發性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)的風險為30%～70%，高劑量烷化劑的應用使化學藥物治療(以下簡稱化療)后閉經的發生率高達40%～80%[4-5]，骨髓移植患者POI發生率可高達70%～100%，故生育力保護非常重要。

對于需要接受性腺毒性療法的女性，可以選擇多種生育力保存方法，即胚胎凍存、卵母細胞凍存和卵巢組織凍存，卵巢組織凍存是近年全球防治醫源性POI的一種重要的生育力保護方法[6-7]，可在一片組織中保存成百上千個卵細胞，不依賴于患者的生理周期，無須超促排卵，不會延誤癌癥的最佳治療時間，不僅能夠有效保存患者生育力，還能在一定程度上恢復卵巢的內分泌功能[8]，是青春期前女孩和需要立即抗癌治療患者的唯一選擇[9]。全球已有超過145個活產嬰兒通過此技術誕生[10]，在過去10年中嬰兒出生數呈指數級增長，研究[11]顯示高達95%的患者移植后卵巢功能恢復，但僅63%的卵巢組織移植后能存活1年，由于卵巢組織移植沒有血管吻合，因此移植物經歷了缺氧和局部缺血的過程，持續3～5 d才能觀察到進行性血管重建，從第7天開始可以看到功能性血管[12]，從第10天開始可以進行有氧代謝重建，卵巢組織在移植后的早期有很多卵泡丟失[13]，因此移植需要進一步優化。本文主要從應用間充質干細胞優化凍融卵巢組織移植，改善凍存卵巢組織移植早期低氧期卵泡丟失等的研究進展進行綜述。

1 卵巢組織凍存移植后早期低氧期損傷

卵巢組織凍存是一項工作密集型的技術，包括卵巢取材手術、組織的處理、冷凍和長期保存，移植物必然是一種非常有限的資源，而且對于患者來說，往往是一種最后的選擇，因此減少卵泡丟失，從而在移植物中保留盡可能多的原始卵泡很重要。對新鮮和凍融卵巢組織比較的研究[14]顯示，卵泡存活率和功能相似。卵巢組織凍存移植過程丟失的卵泡中，據估計至少有75%是在移植過程中丟失，因為移植物在新的環境中重新血管化并恢復內穩態，因此移植后的優化工作可能會對最終的卵泡儲備產生很大的影響。

1.1 卵巢移植后早期卵泡的丟失

竇狀卵泡在卵巢處理過程中會被機械地去除，較小的生長卵泡因極易受到冷凍和復蘇的影響可能會在凍存復蘇過程中丟失。移植后卵泡丟失的機制主要是缺血和激活，移植物中卵泡的存活依賴于缺血、缺氧初期新生血管組織，移植物在低氧環境中營養物質和氧氣由周圍組織通過擴散提供，時間約為3～5 d[11]，在血運重建能夠為移植物提供充分的氧氣和營養前，時間可能需要長達7～10 d[15]。在血管生成期，移植物受到缺血再灌注損傷，導致炎性反應介質、自由基和活性氧的產生[16]，缺血再灌注損傷主要通過影響生長卵泡的顆粒細胞導致卵泡丟失，而原始卵泡由于處于休眠狀態，細胞代謝率較低，比較不容易受到缺血損傷的影響，在血管化較差的卵巢外側皮質中，它們習慣于相對低氧的環境[17]。原始卵泡在移植物中過度募集可能是由于組織處理、凍融以及移植后缺血導致生長卵泡的廣泛丟失所致，生長中的卵泡通過分泌抑制因子，主要是抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone, AMH)在抑制原始卵泡激活方面起著重要作用[18]。移植后立即發生的原始卵泡大量丟失同時伴隨著早期生長卵泡數量的顯著增加和過渡性和早期生長卵泡顆粒細胞增生的增加[14, 19]。在卵巢組織移植患者中，早期也觀察到AMH顯著升高，隨后恢復到低水平，有時檢測不到[20]。

Hippo信號和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)信號是原始卵泡激活的主要調節信號[21]，有研究[22]通過卵巢碎片化或藥物治療，包括第10號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失基因(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)抑制劑和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)激活劑通過破壞Hippo信號來促進體外原始卵泡的激活，從而促進卵泡的生長，以便能夠用于體外受精(in vitro fertilization, IVF)，這也就是體外激活(in vitro activation, IVA)。卵泡激活的多少直接影響移植物的原始卵泡的儲備，移植物中原始卵泡的誘導激活在短期內增加了生長卵泡的數量，但導致移植物壽命縮短，這可能適用于立即獲取成熟卵泡體外受精，但犧牲了移植物的整體生育潛力和長期的內分泌功能。對51例POI患者進行了IVA，總共有5例(10%)妊娠和3例(6%)活產。一般來說，POI患者自然妊娠率為5%～10%，因此IVA的成功率可能低于完全不干預的效果[23]。卵巢組織凍存移植目前主要用于癌癥患者，一旦病情臨床痊愈后，會將卵巢組織自體移植，移植目的是盡可能長時間地恢復卵巢功能，通過激活失去大量原始卵泡會適得其反[24]。相比之下，IVA目前目標是針對卵巢儲備極低，對控制性卵巢刺激反應差的女性，加速激活的目的是在移植后立即刺激少數剩余的卵泡生長[25]。

1.2 卵巢組織移植后的功能

目前卵巢組織移植后95%的患者能恢復卵巢功能，但移植物存活時間各不相同[26]，某些情況下單次移植物可維持功能數年，連續妊娠多達4次，而其他移植物可能在幾個月內停止功能，決定移植物壽命的是移植后移植物中存活下來的原始卵泡的最終數量，分析卵泡丟失的原因對于最大限度延長移植物壽命和優化卵巢組織凍存移植技術是必要的[27]。

卵巢移植物中成熟血管的快速形成對于限制缺血性損傷和移植后高比例卵泡儲備的耗竭非常重要。考慮到移植后存活的卵泡數量減少，但卵巢移植物確實可以存活數年，從而可用于重復懷孕和活產。在人類生殖過程中，卵泡激活和喪失的速率是非線性的，受卵巢內外信號的調節，控制著招募、生長、選擇和閉鎖速率之間的復雜相互作用[28]。卵巢內對卵泡募集的調節包括PI3K-PTEN通路、KIT配體、AMH、神經生長因子(nerve growth factor, NGF)和骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)蛋白家族成員等。此外，研究[29]顯示卵巢的結構和原始卵泡的密度起著自我調節的作用，因此休眠卵泡池的減少會降低招募的速度。卵巢外因素的影響在研究[30]中也得到了證實，接受單側卵巢切除術的患者，其絕經年齡僅比正常絕經年齡早1～2年，在卵巢儲備降低的情況下，身體調整卵泡重新募集率以保存卵泡的這種能力，也可能在卵巢移植中發揮作用。在移植急性期后，卵巢內外的調節因子都可能通過調節招募速率來識別和響應移植物的有限儲備，以減少卵泡激活和丟失，并最大限度地延長移植物的壽命。

2 間充質干細胞的研究應用

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)可以分離自骨髓、外周血、牙髓和臍帶，MSCs具有分化為幾種細胞譜系的能力，例如脂肪細胞、成骨細胞和神經元樣細胞，眾所周知，MSCs在組織再生、血管生成和傷口修復上具有很大的能力[31]，不論來源如何，MSCs都通過分泌各種生物活性分子和細胞因子來支持細胞增生和存活[32]。MSCs的再生和抗凋亡作用是由于它們大量的生物活性分子，包括角化細胞生長因子，堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, FGF)，血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)，BMP-4，胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1, IGF-1)和表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)等，它們是重要的卵泡生成調節劑[33]。根據MSCs與共培養細胞之間的交互作用，利用MSCs作為飼養細胞提供了長期且適當的旁分泌營養因子來源。

臍帶間充質干細胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, UCMSCs)是一種有前途的干細胞來源，用于基于細胞的治療[34]。在多種疾病模型中，如糖尿病[35]、類風濕關節炎[36]等，UCMSCs已顯示出通過免疫調節促進組織修復，并且UCMSCs已在臨床上用于治療新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy of newborn, HIE)[37]。

脂肪來源干細胞(adipose tissue-derived stem cells, ASCs)最早由Zuk等[38]描述，從人脂肪抽吸物中分離出并構成具有多種譜系分化能力的MSCs。由于采用微創手術易于收獲脂肪以及細胞密度高，它們在再生醫學中的應用正在普及。實際上，目前正在進行或已經完成了許多評估ASCs安全性和有效性的臨床試驗(Ⅰ～Ⅱ和Ⅲ期)[39]，對研究[40-41]，已證實了它們具有多系分化潛能、通過分泌生長因子并分化為功能性血管來促進血管生成的能力。ASCs的自分泌/旁分泌因子稱為分泌體(secretome)，參與受損組織的再生過程，誘導血管生成，減少細胞凋亡、細胞死亡，調節免疫系統，分泌體可能是一種新的細胞療法，治療效果與注射活細胞相當，甚至優于注射活細胞，稱為無細胞療法(cell-free therapy)[42]。

3 間充質干細胞在卵巢組織移植中應用的研究

在過去的十年中，卵巢組織移植的主要挑戰之一是延長移植組織的壽命和質量，以便為希望懷孕的癌癥幸存者提供改善妊娠結局的機會。異種移植模型研究[43]采用生長因子(growth factor, GF)如VEGF，抗氧化劑如N-乙酰半胱氨酸[44]、促紅細胞生成素[45]、維生素E、褪黑激素和類固醇激素等方法，但迄今為止，尚未見到可向臨床轉化的顯著改善，還有在食蟹猴自體卵巢移植模型中研究了在移植之前準備血管床[46]。有研究[47-48]采用各種來源的MSCs，利用其促血管生成、抗凋亡和免疫調節特性，2018年Manavella等[49]描述了一種利用ASCs促進異種移植人卵巢組織血運重建的方法，在卵巢組織移植前兩周采用高濃度ASCs來提前準備移植部位，可以提高移植物內部的氧合和血運重建率，并提高卵泡存活率和減少細胞凋亡。Manavella等[49]觀察到移植后7 d卵泡平均存活率為62%，與添加ASCs相關的早期血管化和氧合增加可以解釋卵泡丟失的減少。采用ASCs的移植程序是朝著潛在解決卵巢組織移植后大量卵泡丟失問題邁出的有希望的一步。總之，證明了在移植后早期卵巢組織的含氧和血管形成率更高，這與增加的卵泡存活率和減少的細胞凋亡相關。未來的研究應集中于闡明卵巢組織移植中MSCs的作用機制，以期于臨床應用[50]。

臨床前實驗[51]表明，缺氧處理的ASCs在創面愈合、心肌細胞再生和軟骨修復等方面具有較好的效果，表明其在缺血性疾病和軟骨缺損的治療方面具有巨大的應用潛力，低氧處理的MSCs可能會減少卵巢組織移植早期的卵泡丟失。研究[52]顯示，缺氧對包括ASCs在內的MSCs的有益作用主要歸因于低氧誘導因子-1a(hypoxia-inducible factor -1a, HIF-1a)，缺氧上調HIF-1a，進而增強MSCs的活性、 增生、可溶性因子的分泌、軟骨形成潛能、遷移和植入潛能。在常氧條件下，HIF-1α被抑癌基因產物泛素化，翻譯后被胞質中的蛋白酶體降解，抑制HIF-1α介導的基因轉錄。但缺氧條件下，HIF-1α與血管緊張素轉運蛋白的結合受到抑制，導致HIF-1α穩定并移位到細胞核內。HIF-1α與HIF-1β發生二聚反應，形成HIF-1復合物，該復合體將與靶基因啟動子中稱為缺氧反應元件(hypoxia-responsive elements, HREs)的DNA序列結合。關于低氧條件培養間充質干細胞后與卵巢組織共移植是否可促進卵泡的存活和減少凋亡尚未見報道。

4 小結與展望

卵巢組織凍存移植作為一種生育力保護方法，被越來越多地用于性腺毒性治療的年輕女性，世界各地也出現越來越多的懷孕和活產。卵巢組織移植的目標是盡可能長時間地恢復卵巢功能，以實現多次排卵和妊娠，并恢復內分泌功能。因此優化的重點在于減少移植物中的卵泡損失，以此作為延長移植物壽命和生育力的基礎。減少缺血損傷和/或減少卵泡激活的藥理學方法可以潛在地減少移植后的卵泡丟失，目前研究[50-52]表明間充質干細胞可促進移植物的血管形成，減少卵泡的損耗，從而提高移植物的存活時間，為患者提供更大的長期獲益，但仍需進一步驗證和研究其作用機制，以及研究低氧預處理間充質干細胞是否更加優化卵巢組織移植。