缺血/缺氧預適應的神經保護作用研究進展

吳 劍 谷亞坤 劉 佳*

(1. 首都體育學院運動科學與健康學院， 北京 100191； 2. 首都醫科大學北京腦重大疾病研究院， 北京 100069)

短暫的亞致死性的傷害可以誘導對隨后的致命傷害產生強有力的保護。20世紀末，Murry等[1]證明了多次短暫的缺血發作可以保護心肌免受隨后持續性缺血損傷，這種現象被稱為“缺血預適應”。當然，缺氧并不等于缺血，但兩者往往會導致相同的病理改變，同時可能具有共同的機制。缺血/缺氧預適應對心血管、免疫和呼吸系統疾病的保護作用已被證明[2-4]。近年來研究[5]證實，缺血/缺氧預適應同樣可以抵抗腦損傷，如缺血性卒中、新生兒缺氧/缺血、以及神經退行性疾病等。除原位缺血/缺氧預適應外，通過反復短暫性肢體缺血也可以減輕遠隔器官的缺血損傷，這種“遠隔缺血預適應”現象最近在臨床試驗中得到了廣泛的研究[6]，似乎更具臨床應用價值，因為其避免了對心臟和腦等重要臟器直接進行缺血缺氧的刺激。筆者將重點介紹缺血/缺氧預適應的腦保護機制，其在神經系統疾病中的研究進展，以及將這些臨床前模型轉換到臨床環境中的挑戰。

1 缺血/缺氧預適應的腦保護機制

缺血/缺氧預適應可以通過不同的分子機制發揮腦保護作用。筆者將從低氧細胞信號通路激活、降低能量代謝、抗氧化應激、抗炎性反應等幾個方面討論缺血/缺氧預處理的神經保護機制。

1.1 激活低氧信號通路

氧感應系統主要以缺氧誘導因子(hypoxia inducible factors, HIFs)的調節為核心。HIF家族目前已知有3個成員，HIF-1、HIF-2、HIF-3。HIF-1普遍存在于人和哺乳動物細胞內，是蛋白質合成的關鍵調節因子，由氧敏感性α亞基和結構穩定性β亞基構成。在生理條件下，HIF-1α亞基被脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase domain, PHDs)羥基化，從而促進了其與抑癌基因希佩爾-林道(von Hippol-Lindau, VHL)的結合，導致HIF-1α的泛素化和降解。而在低氧條件下，HIF-1α與HIF-1β結合形成復合物，移位到細胞核，隨后與靶基因上的缺氧反應元件結合，誘導包括多個基因的轉錄激活[7]。

研究[8]表明缺氧預適應可以增加新生和成年動物大腦中的HIF-1。HIF-1被激活后會介導多種下游蛋白的轉錄調控，包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)、葡萄糖轉運蛋白-1(glucose transporter type 1,GLUT1)等，從而響應缺氧。VEGF是低氧時由腎、睪丸、肺、肝、心、腦等器官產生的重要信號蛋白。在大腦中，VEGF可存在于神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞中，可參與調控新生血管的再生，增加缺血部位的毛細血管密度和通透性，減輕缺氧缺血引起的神經損傷[9]。動物模型研究[10]表明，低氧預適應可促進VEGF的表達增加。GLUT1是一類調控細胞外葡萄糖進入細胞內的跨膜蛋白，在腦、血腦屏障、心肌等組織中高表達，負責維持血糖穩定及供能[11]。研究[12]顯示，缺血、缺氧條件下，活化的HIF-1使GLUT-1mRNA及蛋白的基因表達上調，葡萄糖攝取增加，有助于增加神經組織對缺血、缺氧的耐受性。EPO是一種影響紅細胞生成的重要體液因子，對缺血、缺氧敏感，主要通過與紅細胞膜上特異性EPO受體結合發揮促紅細胞增生分化的作用，對神經系統的保護作用涉及抗凋亡、抗炎、抗氧化、營養神經、促神經祖細胞增生分化等多種機制[13]。HIF-1激活的下游基因的蛋白產物在血管生成、血管反應性和重塑、葡萄糖和能量代謝、細胞增生和存活、紅細胞生成和鐵穩態等方面發揮著關鍵作用[7]。因此，上述低氧信號通路的關鍵元件已成為疾病治療研究的重要靶點，在低氧誘導的組織損傷治療方面顯示出巨大價值。

1.2 降低能量代謝

對冬眠和其他耐缺氧狀態下的特定適應性神經保護策略的研究[14]顯示，低氧耐受的機制部分是通過抑制代謝和改變離子通道活性來抑制細胞功能而維持細胞穩態來實現的。研究[15]顯示，與缺血損傷后大量免疫防御策略相關基因的上調相反，缺氧預適應會造成許多基因的轉錄反應被抑制，這些基因參與控制新陳代謝、細胞周期調節和離子通道活動。缺氧預處理同樣造成蛋白質加工相關基因受到抑制，從而使能量需求降低[16]。缺氧預適應可通過抑制某種特定酶而降低脂肪酸代謝，從而減少對ATP的需求。而這一作用在神經系統可直接影響星形膠質細胞，有研究[17]報道星形膠質細胞在葡萄糖、酮體、氨基酸等底物中優先利用脂肪酸代謝產生乳酸，這為鄰近優先使用乳酸進行氧化磷酸化供能的神經元的新陳代謝提供底物。在適應冬眠和缺血期間有限的氧氣供應中，抑制細胞功能作為一種平衡供與需的有效手段。

1.3 抗氧化應激

正常情況下，機體具有有效的內源性抗氧化防御體系，而任何因素導致過量自由基不能被及時清除，將會引起一系列DNA損傷、酶失活、脂質過氧化等損傷[18]。氧化應激是體內氧化與抗氧化失衡的一種狀態。機體在代謝過程中產生過多活性氧(reactive oxygen species, ROS)或清除活性氧的能力下降，是導致衰老或心臟病、癌癥、糖尿病以及神經退行性疾病等多種疾病的一個重要因素。缺血/缺氧預適應可通過多種信號通路、多種因子相互作用的抗氧化應激途徑降低腦損傷[19]。

線粒體呼吸鏈是細胞活性氧的主要來源，線粒體中ROS的產生是腦和心臟缺血耐受的主要觸發因素之一。線粒體是真核生物中負責許多關鍵細胞過程的動態細胞器，其主要功能是通過三羧酸循環和氧化磷酸化供能，調節細胞內鈣(Ca2+)和氧化還原信號，以及調節膜電位并控制細胞程序性死亡。事實上，線粒體在神經損傷中發揮多種保護作用，包括提高神經元活性、減少細胞內Ca2+內流、抑制ROS的產生、抑制細胞凋亡和維持ATP水平。線粒體呼吸鏈和線粒體ROS、解偶聯蛋白-2和錳超氧化物歧化酶都是參與預處理誘導的神經保護反應的靶標和介質[20]。已知氧化應激可引起細胞外鈣離子內流，而細胞可通過內質網、線粒體、高爾基體攝取鈣離子以維持胞質內游離鈣離子濃度穩定[21]。這與缺血/缺氧預處理可通過降低內質網應激和保存高爾基體功能來減少致死性缺血后神經元的死亡的研究結果相一致[22]。近年來，發現了許多具有強抗氧化活性的生物活性分子，包括熱休克蛋白、褪黑素、銀杏內酯、吡咯喹啉醌等[23]。因此，以氧化應激為靶點的新型藥物的研究目前已成為神經系統疾病治療領域的一大熱點。

1.4 抗炎作用

神經系統損傷后引起炎性反應，包括促炎因子，如白細胞介素、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等釋放，星形膠質細胞、小膠質細胞等免疫細胞激活、增生、聚集[24]。機體早期通過炎性反應可清除病原菌，重建穩態，但過度炎性反應則會導致組織損傷。低氧預適應可減輕血-腦脊液屏障的破壞和缺血半球的炎性反應，有助于減輕隨后的中風損害程度和梗死體積[25]。

有研究[26]報道，阿爾茨海默癥模型小鼠經缺氧預適應的骨髓間充質干細胞移植，可降低信號轉導和轉錄激活因子3和NF-kB的活化，上調抗炎因子IL-4和IL-10的表達，下調促炎細胞因子TNF-a和IL-1b的表達，降低星形膠質細胞和小膠質細胞的活化，增加小鼠腦內miR-21水平。研究[27]表明低氧預適應可促進星形膠質細胞成熟，增加谷氨酸轉運體和谷氨酰胺合成酶表達，有助于隨后的缺血缺氧腦損傷的保護。活化的星形膠質細胞還可以通過多種途徑發揮神經保護作用，例如分泌多種神經營養因子、清除興奮毒性物質、調控凋亡信號等。小膠質細胞是中樞神經系統內固有的免疫效應細胞，介導內源性免疫反應，發揮神經保護或毒性作用[28]。在中樞神經系統炎性反應過程中，小膠質細胞具有分化為M1或M2表型的能力，研究[29]顯示M1型主要分泌促炎細胞因子而加劇細胞毒性。M2型主要通過其吞噬功能促進損傷修復，因此目前普遍認為M2表型比M1表型更有利于保護神經元和阻斷疾病進展[30]。研究[3]顯示缺血再灌注損傷會造成M1型小膠質細胞的激活，從而誘導或加劇神經損傷，而缺血/缺氧預適應可通過誘導小膠質細胞M2激活顯著減輕中樞神經系統缺血損傷。

1.5 抗凋亡作用

凋亡是由基因控制的細胞自主有序的主動死亡過程，不同凋亡信號引發不同凋亡信號轉導通路，最后匯集于下游的效應蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase)，進入連續的反應過程。Caspase平時以無活性的酶原形式存在，激活途徑主要有：受體激活途徑，死亡信號(如TNF-α等)通過與細胞表面受體結合激活；線粒體激活途徑，死亡信號作用下，線粒體膜受損，釋放細胞色素c進入胞質與凋亡激活因子、ATP、Caspase 9等形成復合物，最后激活Caspase 3，引發級聯反應[31]。缺血再灌注后TNF-α、細胞色素c含量及Caspase 3活性均升高。缺血預適應或缺血后適應實驗[32]證實其可降低凋亡相關基因的表達及Caspase 3活性，證明了這種干預方式具有抗凋亡作用。

1.6 降低興奮性毒性

興奮性毒性是指由于神經元去極化，造成谷氨酸等興奮性神經遞質釋放引起的病理過程。興奮性毒性與多種神經系統疾病密切相關[33]。缺血受損的神經細胞釋放興奮性神經遞質谷氨酸，可以刺激突觸前谷氨酸受體如NMDA受體和AMPA受體，促進更多谷氨酸的釋放。當突觸間隙周圍的谷氨酸濃度過高，神經元被興奮性毒性殺死[34]。中樞神經系統谷氨酸穩態主要受興奮性氨基酸轉運體攝取活性的調節，其主要分布在星形膠質細胞，又被稱為膠質谷氨酸轉運體蛋白-1[35]。研究[36]證實，腦缺血預處理可通過上調膠質細胞谷氨酸轉運體-1活性降低谷氨酸興奮性毒性，從而誘導腦缺血耐受。

1.7 激活自噬

自噬是一種細胞自我保護的方式，自噬過程是通過雙層膜包裹待降解物形成自噬體，運送到溶酶體形成自噬溶酶體并進行多種酶的消化和降解，控制著許多重要生理功能，對生存、分化、發育和動態平衡至關重要。根據細胞物質遞送到溶酶體的途徑不同，分為巨自噬、微自噬、分子伴侶介導的自噬。巨型自噬是目前研究最多的形式，研究[37]顯示它有助于維持細胞成分的降解、合成和循環之間的平衡，并且與細胞死亡途徑相關。自噬代表了一種適應性策略，在面對饑餓、感染和各種應激時，可以通過清除受損的蛋白質和線粒體，快速提供燃料供應能量，以及支持凋亡過程來維持細胞的動態平衡，從而延緩細胞死亡。在神經系統體外細胞模型中，低氧預適應增加了自噬小體的生成和降解[38]。體外缺血模型實驗[39]也顯示，亞致死性缺氧可刺激再灌注過程中的自噬，使細胞結構或自噬小體對隨后的致命性損傷具有抵抗力。

2 缺血/缺氧預適應在神經系統疾病中的研究進展

神經系統疾病是一類多種原因波及腦血管及神經組織等的急/慢性、進行性加重的疾病，發病率高、危險性大。中樞神經系統疾病主要包括腦血管疾病、神經系統變性病、中樞感染性、免疫性、外傷性以及腫瘤性疾病等。其中最常見的是腦血管疾病，包括卒中、腦出血、蛛網膜下腔出血等;其次是一些神經退行性疾病，包括帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)、亨廷頓病(Huntington disease，HD)、肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等。神經系統疾病的發病機制復雜，涉及興奮性毒性、細胞凋亡、氧化應激、免疫炎性反應等眾多方面。缺血/缺氧預處理作為一種有潛力的治療策略，已經在多種臨床前研究中被證實具有神經保護作用[5]。以下將簡介缺血/缺氧預處理在神經系統相關疾病中的應用研究進展。

2.1 腦血管病

缺血性腦卒中是由腦血管閉塞引起的，占腦卒中病例的80%。溶栓組織型纖溶酶原激活劑治療急性缺血性卒中療效較好，但治療窗口較窄，所以尋找到早期預防的有效干預方法尤為重要[40]。在局灶性和全局性腦缺血的動物模型研究[41]表明區域特異性預處理刺激的誘導用于隨后的神經保護。短暫性腦缺血發作(transient ischemic attack, TIA)可以被認為是一種原位的缺血/缺氧預適應，研究[42-43]顯示卒中前有TIA病史的患者，初始彌散性病變往往較小，最終梗死體積也明顯減小，同樣揭示了缺氧/缺血預適應的保護作用。出血性卒中約占卒中的20%，治療選擇非常有限。缺血預處理可以減少蛛網膜下腔出血后的血管痙攣和遲發性腦缺血[44]。研究[45]報道了腦動脈瘤手術中的缺血預適應。在復雜的腦血管手術中，暫時阻斷近端動脈可能是一種簡單的腦保護操作。Sales等[46]也發現術前遠隔缺血預處理降低了接受腦腫瘤手術切除的患者術后缺血性損傷的發生率。

2.2 神經退行性疾病

神經退行性疾病是指神經元進行性功能障礙和選擇性死亡而誘發的一類神經系統疾病。這類疾病通常發病隱匿，進展緩慢，進一步研究缺血/缺氧預適應對于預防改善神經退行性疾病的作用具有重要意義。神經退行性疾病和卒中在神經元死亡前有著共同的病理生理過程。在神經退行性腦中可觀察到血管異常、神經血管解偶聯和自由基損傷。越來越多的證據[5]表明，間歇性低氧訓練可以改善腦血管功能，在實驗性AD中，間歇性低氧幾乎阻止了腦血管和腦外血管的內皮障礙、腦血管網的稀疏和大腦皮質神經元的丟失，減輕AD病理，進而改善AD動物的腦灌注和認知功能[47]。間歇性低氧不僅對血管有作用，還可以防止神經元退化、刺激神經發生和再生[48]。在帕金森病的細胞模型中，外源性Wnt 1通過激活Wnt/β-catenin信號通路來阻止6-羥基多巴胺介導的線粒體損傷[49]。而缺氧誘導因子-1α可通過Wnt/β-catenin信號調節細胞對適應性過程的反應[50]。

2.3 多發性硬化癥

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是以中樞神經系統白質炎性脫髓鞘病變為主要特點的自身免疫病，是中青年人群中最常見的神經系統疾病。其病因和發病機制尚未完全明確，可能涉及自身免疫、病毒感染、遺傳傾向、環境因素及個體易感等綜合因素。特征性病理改變是中樞神經系統白質內多發性脫髓鞘斑塊，多位于側腦室周圍，伴反應性膠質增生，也可有軸突損傷[51]。病變常累及腦室周圍白質、視神經、脊髓、腦干和小腦[52]。實驗性變態反應性腦脊髓炎(experimental allergy encephalomyelitis，EAE)，其免疫發病機制和病損與MS相似[53]。在受EAE影響的小鼠的脊髓中，慢性中度低氧處理通過誘導抗炎環境來部分保護EAE小鼠，與調節性T細胞(Tregs)和抗炎細胞因子IL-10濃度增加相關[54]。除對免疫系統發揮抗炎作用外，低氧預處理對血管的強大重塑性也得到了不斷證實。研究[55]表明，低氧預適應可通過優化血-腦脊液屏障完整性來抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎，包括減少血管細胞黏附分子-1和細胞間黏附分子-1的表達，維持內皮緊密連接蛋白-1和閉合蛋白的表達，以及上調血管基底膜中層粘連蛋白-111的表達等。

2.4 脊髓損傷

脊髓損傷是脊柱損傷最重要的合并癥，可導致損傷節段以下肢體嚴重的功能障礙。損傷往往伴隨著一系列病理變化，包括神經元壞死、軸突變性、炎性反應、脫髓鞘、膠質瘢痕形成等。針對脊髓損傷的治療研究以往主要集中于早期救治、藥物治療、合并癥治療等方面，近年來應用低壓氧及高壓氧預處理的物理干預手段得到一些研究者的關注。研究[56]表明，間歇性低氧可以改變突觸可塑性，增加運動神經元中生長因子與營養因子的表達，并改善脊髓損傷大鼠的前肢運動功能。干細胞移植是治療缺血性卒中、脊髓損傷、神經退行性疾病等的一種很有前途的再生療法。低氧預處理與干細胞治療相結合具有廣泛的臨床應用價值。低氧預處理的骨髓間充質干細胞移植可以促進大鼠腦缺血后血管生成和神經再生[57]。神經干細胞和缺氧預處理的間充質干細胞進行的另一項聯合移植試驗[58]也顯示，神經干細胞移植到脊髓損傷部位后存活率提高。

3 小結

目前，有關神經系統疾病的很多預處理應用正在探索中。首先，需要考慮人群亞群的治療異質性，包括年齡、 性別、飲食習慣等，以及建立標準化的機制或最佳刺激。預處理刺激的最佳持續時間、頻率和大小因疾病而異，不同的低氧程度、持續時間、發作周期等將會產生截然不同的效應。其次，缺血/缺氧預適應的主要限制之一是，缺乏衡量或判斷預適應效果的指標。特別是在慢性神經退行性疾病的情況下，對慢性應激細胞施加輕微的壓力可能會加劇疾病狀態，而不是提供治療。這不僅需要了解預處理刺激和疾病的機制，而且還需要了解疾病不同階段的病變細胞/組織/器官對輕度應激的反應，并尋找特定的生理生物標記物，從而更好地監控疾病進展或治療效果。另外，將缺血/缺氧預適應與傳統的藥物治療、干細胞移植等結合，是一種具有重要意義和潛力的療法，仍有待深入探索。