骨髓間充質干細胞對COPD-OSA重疊綜合征大鼠肺血管內皮損傷的修復作用觀察

陳敏，黃照明，郭翔，畢虹，杜俊毅，楊超，楊麗娟，王麗艷，邱云花，金志賢 昆明市第一人民醫院附屬甘美醫院，昆明650224

慢性阻塞性肺疾病(COPD)-阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)重疊綜合征是由COPD和OSA重疊構成的一種疾病。研究表明，COPD、OSA均存在血管內皮損傷，而COPD-OSA重疊綜合征患者內皮功能紊亂更重，且與疾病嚴重程度相關[1]。在前期研究中，本課題組成功采用煙熏聯合間歇低氧法構建出COPD-OSA重疊綜合征大鼠模型，并證實COPD-OSA重疊綜合征大鼠體內存在血管內皮損傷[2]，但對于該重疊綜合征血管內皮損傷修復治療的研究目前尚處于初始階段。Kim等[3]研究發現，間充質干細胞(MSCs)通過靜脈輸注后主要滯留在肺組織，并且肺氣腫模型組比正常組MSCs數量更多。骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有多向分化潛能，可能通過遷移、趨化到達病變部位發揮免疫調節功能，并具有抑制炎癥反應、分泌細胞信號進行細胞間信息傳遞的功能[4,5]。2016年10月～2018年12月，本研究對COPD-OSA重疊綜合征大鼠尾靜脈注入BMSCs，觀察其對大鼠肺血管內皮損傷的修復作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：SPF級雌性SD大鼠18只，6～8周齡，體質量150～180 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；飼養和實驗均在成都軍區昆明總醫院實驗動物中心屏障環境中進行，飼養環境溫度20～25 ℃，濕度60%±5%。主要試劑：99%氮氣購自昆明氧氣廠，DMEM/F12、胎牛血清(FBS)、細胞培養瓶、0.25%胰酶均購自昆明貝爾吉生物科技有限公司，內皮素1(ET-1)、血管內皮生長因子(VEGF)、基質細胞衍生因子1α(SDF-1α)ELISA試劑盒均購自青島華美生物科技有限公司，內皮型一氧化氮合酶(eNOS)購自武漢優爾生生命科學裝備有限公司，BMSCs表面標記CD90-FITC抗體、CD45-FITC抗體、CD29-FITC抗體、CD19-Fluor 488抗體均購自美國 eBioscience公司，CD34-cy3熒光抗體購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 BMSCs的分離、培養及鑒定 取SPF級雌性SD大鼠2只，采用頸椎脫臼法處死大鼠，無菌條件下取大鼠雙側股骨及脛骨；清除骨表面筋膜及肌肉，剪斷骨骺端，暴露骨髓腔。使用10 mL無菌注射器吸取無FBS的DEME-F12培養基，反復沖洗骨髓腔；將骨髓液收集至離心管中，1 200 r/min離心5 min，反復吹打成單細胞懸液。棄上清，用含FBS的DMEM/F12完全培養基重懸稀釋;移至T75細胞培養瓶中,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養，48 h后首次換液。去除未貼壁細胞，根據細胞生長速度，2～3 d換液1次。待細胞融合度達90%時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1∶3傳代，繼續培養。取第3代純化的細胞，100倍顯微鏡下觀察細胞形態，結果顯示細胞呈長梭形、漩渦狀生長；采用流式細胞儀檢測BMSCs表面標記CD19-Fluor 488、CD29-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC表達，結果顯示分離的細胞表達CD29、CD90，不表達CD19、CD45；參照BMSCs成骨誘導分化、成脂誘導分化試劑盒說明書對其進行體外誘導分化實驗，結果顯示其具有成骨、成脂分化能力。所培養的細胞表型及功能鑒定均符合BMSCs特點，證實分離培養的細胞為BMSCs。

1.3 建模及分組處理 取SPF級雌性SD大鼠16只，參照前期試驗采用煙熏聯合間歇低氧的方法制備COPD-OSA重疊綜合征大鼠模型，并進行驗證[2]。將16只COPD-OSA重疊綜合征大鼠隨機分為觀察組和對照組，每組8只。取第3代BMSCs，經消化、離心、生理鹽水重懸，制備密度為2×106/mL的細胞懸液。自建模開始后第4周開始，觀察組經尾靜脈注射BMSCs 1 mL/次，1次/周，共4次；對照組經尾靜脈注射等體積、等次數的生理鹽水。

1.4 肺組織標本獲取 兩組治療后1周，給予10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，取右肺下葉于4%多聚甲醛固定24 h，避光保存待檢；取左肺組織，置入凍存管，-70 ℃冰箱保存待檢。

1.5 肺組織及肺小動脈病理觀察 取兩組4%多聚甲醛固定的右肺下葉，乙醇脫水后常規石蠟包埋、3 μm厚切片。行HE染色，觀察肺組織病理改變；行MASSON染色，觀察肺小動脈病理改變。

1.6 肺組織血管內皮細胞凋亡情況觀察 采用DAPI-CD34-TUNEL三重定性法。取兩組4%多聚甲醛固定的右肺下葉，乙醇脫水后常規石蠟包埋、3 μm厚切片。進行DAPI細胞核染色(藍光)，CD34免疫熒光(紅光)和TUNEL法檢測凋亡細胞(綠光)。觀察標本的特異性紅色熒光強度，同時顯示藍光和紅光的細胞為CD34陽性的血管內皮細胞，同時顯示藍光、紅光、綠光的細胞為凋亡的CD34陽性血管內皮細胞。針對每例標本的藍光-紅光-綠光合成圖，每組內每張切片挑選至少3個400倍視野進行截圖，截圖時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。采用Image-Pro Plus6.0軟件選取發出紅色-綠色熒光的細胞核定義為陽性細胞，選取發出藍色的細胞核定義為總細胞，分析每張照片的陽性細胞數以及總細胞數。細胞凋亡率=陽性細胞數/總細胞數×100%，取平均值。

1.7 肺組織ET-1、eNOS、VEGF、SDF-1α表達檢測 采用ELISA法。取兩組冰箱保存的左肺組織，勻漿后離心；設標準孔、待測樣本孔，每孔加標準品或待測樣本100 μL，37 ℃孵育2 h；分別加入生物素標記抗體工作液、加辣根過氧化物酶標記親和素工作液，避光顯色；使用酶標儀檢測各孔的光密度(OD)值。嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 兩組肺組織、肺小動脈病理改變情況 ①肺組織病理改變：對照組呈現明顯的肺氣腫特征，肺泡腔擴大，部分肺泡破裂融合，肺泡腔內見炎性滲出；支氣管壁大量淋巴細胞增生，細支氣管管壁平滑肌增生、杯狀細胞增生；肺間質淋巴細胞浸潤，間質增厚，氣管壁淋巴細胞浸潤，部分血管壁淋巴細胞、漿細胞浸潤。觀察組肺氣腫程度較輕，肺間質淋巴細胞、中性粒細胞浸潤以及支氣管壁淋巴細胞增生、細支氣管管壁平滑肌增生、杯狀細胞增生等改變均較對照組減輕。見圖1。②肺小動脈病理改變：對照組肺小動脈肌化明顯增強，外膜膠原纖維高度沉積，血管壁正常結構喪失，血管周圍炎癥明顯，肺間質增厚明顯；觀察組肺小動脈肌化、外膜膠原纖維沉積、血管壁結構異常、血管周圍炎癥、肺間質增厚等均較對照組減輕。見圖2。

注：A為觀察組;B為對照組。

2.2 兩組肺組織血管內皮細胞凋亡率比較 觀察組與對照組肺組織血管內皮細胞凋亡率分別為2.355 2%±0.392 3%、1.333 9%±0.155 3%，兩組比較P<0.01。

2.3 兩組肺組織ET-1、eNOS、VEGF、SDF-1α表達比較 觀察組肺組織ET-1、VEGF表達均低于對照組，eNOS表達高于對照組(P均<0.05)。兩組肺組織SDF-1α表達比較P>0.05。見表1。

注：A為觀察組;B為對照組。

表1 兩組肺組織ET-1、eNOS、VEGF、SDF-1α表達比較

3 討論

血管內皮的完整性對于人體血液循環和全身組織的生理屏障作用至關重要，但缺氧、炎癥、氧化應激、交感神經活性改變等因素均參與了COPD、OSA的發生、發展，這些因素均可引起血管內皮損傷及功能障礙[6,7]，從而導致血管收縮、血液高凝甚至形成血栓，從而引發心腦血管事件的發生。在前期研究中我們已證實COPD-OSA重疊綜合征大鼠體內存在血管內皮損傷，但目前對于這種損傷的修復治療尚處于初始階段。

BMSCs是未分化的細胞，能從骨髓動員到其他器官，歸巢到受損傷組織，可以分化血管內皮細胞在內的多種細胞，從而發揮修復功能。BMSCs具有取材方便、培養簡單、增殖快、免疫原性低等特點，并具有免疫調節作用，可調節炎癥及氧化應激。既往研究發現，BMSCs條件培養基可以抑制低氧誘導的主動脈血管內皮細胞凋亡，從而修復血管內皮損傷[8]。有研究將BMSCs條件培養基注射到大鼠皮膚傷口，發現BMSCs可修復血管內皮損傷、促進新生血管形成，從而促進皮膚傷口愈合[9]。研究顯示，BMSCs可修復野百合堿所致肺動脈高壓大鼠模型的血管內皮損傷、減輕肺血管重塑、改善血管舒張功能、有效降低肺動脈壓力及改善心功能[10]。結合既往關于COPD、OSA及肺動脈高壓等動物模型實驗結果，推測BMSCs修復血管內皮損傷的機制可能有：①下調多種炎癥介質(如IL-6、IL-1β、C反應蛋白等)來抑制炎癥反應[11,12]；②抑制氧化應激反應[13,14]；③分泌某些抗細胞凋亡因子(如IL-6、人單核細胞趨化蛋白1)及促進血管生長因子(如VEGF)，從而抑制血管內皮細胞凋亡，還可能分泌某些細胞因子激活PI3K/AKT通路而抑制血管內皮細胞凋亡[8]；④分化為血管內皮細胞及平滑肌細胞,以減輕血管內皮細胞凋亡[10,15]。

NO和ET-1是相拮抗的內皮源性舒張因子，可有效反映血管內皮損傷的狀態。NO由eNOS催化底物L-精氨酸合成，低氧可造成內皮細胞eNOS合成減少、活性降低。VEGF是特異性促進血管內皮細胞有絲分裂的生長因子，其合成和分泌受缺氧、癌基因、細胞因子、細胞間質成分等多種因素影響[16]。SDF-1α是細胞膜半胱氨酸-X-半胱氨酸趨化因子之一，可動員內皮祖細胞到外周血，并遷移到血管受損處，具有修復損傷血管內皮及促進新生血管形成的作用[17,18]。本研究結果顯示，對照組呈現明顯的肺氣腫特征，具有肺間質淋巴細胞、中性粒細胞浸潤以及支氣管壁淋巴細胞增生、細支氣管管壁平滑肌增生、杯狀細胞增生等明顯改變，肺小動脈病理變化顯示肌化、外膜膠原纖維沉積、血管壁結構異常、血管周圍炎癥、肺間質增厚等明顯改變，而觀察組上述變化均較對照組減輕，說明BMSCs對COPD-OSA重疊綜合征大鼠的肺血管內皮損傷具有明顯的修復作用。本研究結果顯示，觀察組肺組織血管內皮細胞凋亡率及ET-1表達均低于對照組，eNOS表達高于對照組；說明BMSCs可能通過降低血管內皮損傷因子ET-1表達及升高血管內皮保護因子eNOS表達，而發揮減輕血管內皮損傷的作用。

研究表明，缺氧可引起血管內皮細胞合成缺氧誘導因子，激活缺氧感受基因，繼而引起 VEGF表達上調[19]。間歇低氧可刺激HIF-1α、VEGF、SDF-1α為主的大量交感刺激因子逐漸釋放以適應低氧[20]。COPD-OSA重疊綜合征患者血清VEGF水平高于中重度COPD及中重度OSA患者[21]。另有研究表明，BMSCs本身具有分泌VEGF的作用，尾靜脈移植BMSCs可在COPD大鼠模型肺組織定植、分化為肺泡壁細胞，肺泡壁細胞亦可分泌VEGF等物質[22]。本研究結果顯示,觀察組肺組織VEGF表達低于對照組；結合目前相關研究，分析原因可能為BMSCs尾靜脈移植治療通過改善大鼠缺氧、炎癥、氧化應激等機制，導致其對VEGF的降低作用超過了BMSCs通過自身分泌及轉化為肺泡壁細胞后分泌對VEGF的升高作用，但仍需進一步研究證實。