骨髓間充質干細胞移植在缺血性腦卒中治療中的應用研究進展

劉玉林，閔瑜，黃臻 廣州市番禺區中心醫院，廣州511400

腦卒中是導致人類死亡和殘疾最常見的原因，具有高發病率、高病死率、高致殘率和不可預知等特點，嚴重地威脅人類健康并影響患者生存質量[1]。溶栓治療和經皮血管內干預是目前臨床常用的治療手段，可在一定程度上降低了患者的病死率，但該方法受時間窗的限制，臨床上亟需尋找其他更為有效的治療手段。近年來研究發現，干細胞移植治療是促進腦卒中后患者功能恢復的有效方法之一[2]。干細胞是一類具有自我更新、多向分化潛能的未分化細胞群體，在一定的條件下可以分化成多種功能細胞、組織或器官。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是干細胞成員之一，具有可自體取材、增殖速度快、易體外培養、低免疫原性、無倫理學限制等特點[3～5]。目前研究顯示，BMSCs不僅可以通過分化成神經元來修復卒中后的腦組織[6, 7]，還可以通過調節受損腦組織的微環境[8]，減輕炎癥反應，促進血管生成、神經發生、神經血管修復等[9, 10]，發揮減少梗死面積和減輕血腦屏障破壞的作用。本文將對BMSCs在缺血性腦卒中治療中的移植時機、移植途徑及其應用作一綜述。

1 BMSCs在缺血性腦卒中治療中的移植時機、移植途徑

1.1 BMSCs的移植時機 缺血性腦卒中超早期溶栓有4.5 h時間窗的限制，因此只有較少數患者能從中受益，而BMSCs移植可明顯延長缺血性腦卒中治療的時間窗，在急性期、亞急性期和慢性期缺血性腦卒中的治療中均有效。既往認為，缺血性腦卒中患者應盡早進行BMSCs移植治療。但Yavagal等[11]發現，在腦缺血后1 h通過動脈移植BMSCs后，患者的梗死面積并沒有顯著減少，而在腦缺血后24 h進行移植的患者梗死面積明顯減小，說明在超急性期移植BMSCs的神經保護作用并不明顯，可能需經過一段時間后，機體才會產生更高濃度的趨化因子，從而促進BMSCs的內皮轉運。Rosenblum等[12]也發現，適當延遲腦卒中后干細胞移植時間可顯著提高療效；該研究認為，在腦組織缺血后的超急性期進行動脈移植BMSCs可能是不利的，而在超急性炎癥反應減弱或消退后的幾天進行移植可帶來較好的效果。Kawabori等[13]研究顯示，在缺血性腦卒中后1周移植低劑量和高劑量BMSCs均可顯著促進患者的功能恢復，而在缺血性腦卒中后4周進行高劑量BMSCs移植的患者功能恢復情況優于低劑量者；認為不宜在缺血性腦卒中超急性期進行BMSCs移植治療，而在恢復期的移植治療可能需要提高移植細胞數量才能達到有效效果。因此，BMSCs移植治療還需嚴格把握時間窗，其最佳治療時間目前尚無定論，這也是需要深入研究的方向之一。

1.2 BMSCs的移植途徑 在動物實驗中BMSCs的移植途徑主要有立體定向腦內注射法及經外周靜脈注射、頸動脈注射、鞘內注射等，而在臨床實驗中多采用立體定向腦內注射及經外周靜脈注射、頸動脈注射。立體定向腦內注射可將干細胞精確移植于病灶處，使梗死區及周邊有更多的移植細胞，有助于細胞成活和分化，從而促進組織損傷修復；但是，立體定向腦內注射是一種有創性操作，可引起顱內感染、發熱、局部損傷等不良反應，導致其臨床應用受限[14, 15]。經外周靜脈注射是一種應用比較廣泛的移植方法，具有安全性高、可重復操作等特點，患者更容易接受，更適用于臨床應用。雖然干細胞可通過血液循環趨化至受損組織發揮作用，但移植的干細胞從外周血管進入腦內需經較長時間的遷移，可能經過肝臟的首過代謝，而且通過肺循環也會損失一定數量的細胞，導致最后進入腦內的細胞數量十分有限，而注入足夠數量的干細胞有可能增加血栓形成的風險。因此，相對于經外周靜脈移植，頸動脈移植不需經過其他器官而損失大量的細胞，可更直接、更快速地到達病灶部位，但因BMSCs體積較大，有可能形成微栓子，有造成新發梗死的可能。有研究者通過動脈、靜脈和腦內途徑分別移植BMSCs，發現3種途徑移植的BMSCs均可促進梗死側胼胝體區域軸突髓鞘的重建，而經動脈移植的患者神經功能恢復的程度最好、速度最快[16]。鞘內注射的方法可使BMSCs隨腦脊液分布至整個大腦和脊髓，但到達病灶部位的細胞數量并不多，常用于治療廣泛病變，不適合治療小范圍病變。對于選擇何種移植途徑，需結合腦卒中梗死的面積、位置、形狀、移植細胞的數量等情況，如梗死面積大、梗死及其周邊血運好，可選擇動脈或靜脈注射方式進行BMSCs移植治療[17]。

2 BMSCs移植在缺血性腦卒中治療中的應用

2.1 單純BMSCs移植 目前研究證明，BMSCs移植對缺血性腦卒中患者具有神經保護及損傷修復作用，其機制可能與促進血管生成、神經發生、神經血管修復等有關。王宗立等[18]采用線栓法建立大腦中動脈栓塞大鼠模型，在建模成功后3 h通過立體儀注射同種異體BMSCs懸液，發現BMSCs可明顯改善腦缺血再灌注大鼠的神經功能，其機制可能與上調survivin蛋白表達、下調Caspase-3表達并減少腦缺血再灌注大鼠神經細胞凋亡有關。Zhang等[19]在大鼠腦缺血21 d時采用經股靜脈注射BMSCs移植治療，結果發現 BMSCs移植也可明顯改善腦缺血恢復期大鼠的神經功能缺損，并有助于減小缺血灶體積、減少瘢痕組織形成，其機制與下調Nogo-A、NgR、RhoA及ROCK等表達，減輕炎癥反應對軸突生長的抑制作用等有關，這表明BMSCs移植在腦缺血恢復期的治療中仍有作用。

除了基礎實驗方面的研究，BMSCs移植治療在臨床實驗中也有了較大進展。Lee等[20]對52例大腦中動脈梗死患者進行了觀察者單盲臨床實驗和長達5年的隨訪，發現靜脈自體BMSCs移植治療腦卒中是安全、有效的。Honmou等[21]對12例缺血性卒中患者靜脈注射大劑量BMSCs懸液[細胞數為(0.6～1.6)×108個]，結果顯示患者的NIHSS均持續改善，在輸注BMSCs 1周后，磁共振成像評估顯示平均病變體積減小>20%，治療后1年隨訪顯示患者未發生任何中樞神經系統腫瘤、異常細胞生長、靜脈血栓栓塞、全身惡性腫瘤或全身感染等不良反應。由此可見，BMSCs移植是治療缺血性腦卒中的有效措施，且安全性較高。

2.2 經基因修飾后BMSCs移植 為了進一步提高BMSCs的移植效能，有研究將BMSCs經基因修飾后作為供體細胞，目的是使BMSCs在大腦組織中表達相應的目的基因[22]。程率芳[22]通過構建血管內皮生長因子(VEGF)基因表達載體并轉染SD大鼠的BMSCs，發現攜帶 VEGF基因的BMSCs可以改善腦缺血大鼠的神經功能，減小腦缺血面積，并能促進缺血性腦組織的血管生成；且大鼠缺血半暗帶內有明顯的新生血管，并且向梗死中心區域延伸、增多。Zhang等[23]將TSP4基因通過慢病毒表達載體系統轉染BMSCs，發現TSP4-BMSCs可通過上調TGF-β/Smad2/3信號通路，增加血管性假血友病因子(VWF)、血管生成素1(Ang-1)、基質金屬蛋白9(MMP-9)、基質金屬蛋白2(MMP-2)在腦缺血半暗帶中的表達，從而促進內皮細胞增殖、遷移和管狀形成；此外，TSP4-BMSCs輸注明顯改善了大腦中動脈栓塞大鼠的神經功能評分，并可促進腦卒中后神經功能的恢復，較野生型BMSCs具有更好的治療效果。因此，基因修飾后的BMSCs可在腦卒中治療中發揮積極作用，比單純BMSCs可能有更好的治療效果，但目前主要為基礎研究，還需要更多的臨床實驗進一步證實。

2.3 BMSCs移植聯合藥物治療 研究表明，阿魏酸鈉聯合BMSCs注射可通過上調基質細胞衍生因子1α(SDF-1α)/趨化因子受體4軸，促進BMSCs向腦內缺血組織遷移，同時促進外源性BMSCs向神經樣細胞和星形細胞分化，并通過促進腦卒中后糖代謝和內源性神經發生來增強腦實質細胞的修復能力，顯著縮小缺血性腦卒中的梗死范圍；其機制可能與上調骨形態發生蛋白(BMP)2/4，下調Notch-1、Hes1和Hes5表達有關[24]。此外，Wang等[25]發現，靜脈注射黃芪甲苷聯合BMSC移植治療可顯著促進缺血性腦卒中患者的功能恢復和血管生成，聯合治療的療效明顯優于單一治療，其機制可能與黃芪甲苷通過上調SDF-1和VEGF表達而促進BMSCs存活和遷移有關。此外，依達拉奉[26]、補陽還五湯[27]、NO[28]、紅細胞生成素[29, 30]等聯合BMSCs移植對缺血性腦卒中的治療效果均較好。BMSCs聯合藥物可以起到更好的協同效應，其原因可能是聯合藥物可促進內源性干細胞增殖、提高干細胞存活及遷移、促進神經營養因子分泌、促進血管生成等。

綜上所述，單純BMSCs移植、經基因修飾后BMSCs移植及BMSCs移植聯合藥物治療3種方法對缺血性腦卒中的治療均有積極作用，具體哪種治療方法的效果最佳尚無定論，有待更多大樣本、隨機對照研究進行探討。關于BMSCs移植治療缺血性腦卒中不管在基礎實驗還是臨床研究均有了較大的進展，但仍有很多問題需進一步研究，比如移植治療的最佳時間窗、細胞劑量及途徑等。臨床中每例腦卒中患者的病情輕重不同，其梗死部位、大小、年齡等各有差異，因此在臨床治療中尋找最佳的移植方案遠比動物實驗復雜得多。此外，動物實驗基本上選擇健康的年輕雄性動物，在臨床研究中還缺乏關于合并糖尿病、高血壓等基礎疾病對BMSCs治療缺血性腦卒中效果的影響；同時目前臨床研究的樣本量、隨訪時間及安全性研究等均不足，還需要多中心、大樣本、雙盲、安慰劑對照、隨機臨床試驗提供更多依據。