農藥殺蟲劑的雄性生殖毒性作用機制研究進展

郭茂，韓勇，徐陶，陳琰，李興元，孔德營 遵義醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，貴州遵義563000

殺蟲劑是農藥的一個重要組成部分，目前常見的農藥殺蟲劑主要有4大類，包括有機氯類、有機磷類、擬除蟲菊酯類和氨基甲酸酯類。有機氯類目前應用較少，主要包括滴滴涕、六六六和硫丹等；該類殺蟲劑結構較穩(wěn)定，難以氧化和分解，具有高毒、高效、高殘留的特點，因而目前絕大部分國家已經逐漸禁用該類殺蟲劑。但有機氯類殺蟲劑化學性質穩(wěn)定，可長期殘留在土壤和生物體內達數十年，因此有機氯農藥的雄性生殖毒性仍是目前的研究熱點。有機磷類殺蟲劑具有經濟、高效、殺蟲譜廣等特點，至今仍廣泛應用于農業(yè)生產，該類殺蟲劑主要包括敵百蟲、敵敵畏、馬拉硫磷和毒死蜱等。擬除蟲菊酯類殺蟲劑具有高效、低毒、廣譜、擊倒快、殘留少等特點，被廣泛應用于農業(yè)生產和家庭生活中，常用的有氰戊菊酯、氯氰菊酯和溴氰菊酯等。氨基甲酸酯類殺蟲劑除少數品種，如呋喃丹等毒性較高外，大多數屬中、低毒性，且殺蟲活效強、殺蟲譜廣，被廣泛應用于農業(yè)生產，常用的有西維因、滅多威和呋喃丹等。隨著殺蟲劑使用的增加，人類接觸殺蟲劑的機會也愈來愈多，其引起的生殖健康危害也引起了世界各國學者的廣泛關注，越來越多的研究致力于揭示殺蟲劑的雄性生殖毒性的作用機制。本文將目前使用和研究較為廣泛的幾類農藥殺蟲劑的雄性生殖毒性作用機制作一綜述。

1 干擾生殖內分泌功能

雄性的精子發(fā)生主要受卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)介導的睪酮(T)調控，因此雄性體內生殖激素T、FSH、LH水平對維持精子發(fā)生的微環(huán)境具有重要作用。此外，雌激素(E2)也是調控雄性生殖的重要因素，這主要與E2能夠刺激生精干細胞的增殖有關。研究顯示，多種農藥殺蟲劑可干擾雄性的生殖內分泌功能，影響其性激素水平，而導致生殖障礙[1,2]。

1.1 有機氯農藥的生殖內分泌干擾作用 研究表明，有機氯農藥硫丹可通過影響雄激素合成相關的蛋白和酶，如類固醇激素合成急性調控蛋白(StAR)、細胞色素P450膽固醇側鏈裂解酶(P450scc)、17β-羥化類固醇脫氫酶(17β-HSD)和3β-羥化類固醇脫氫酶(3β-HSD)等的表達和活性來干擾T生成[1]。此外，Zhou等[3]發(fā)現，有機氯殺蟲劑可通過類固醇外源性受體(SXR)介導CYP3A和CYP7A1表達，干擾膽固醇和類固醇的代謝而影響類固醇激素水平。

1.2 有機磷農藥的生殖內分泌干擾作用 類似于有機氯農藥，有機磷農藥也具有干擾雄性激素合成相關酶和蛋白基因表達的作用[2]。進一步發(fā)現，有機磷農藥毒死蜱是通過LH/LHR/PKA/CREB通路干擾雄性激素合成關鍵蛋白StAR表達[4]。同時，有機磷農藥可影響下丘腦和垂體功能，干擾下丘腦促性腺激素釋放激素和垂體促性腺激素分泌，從而間接影響雄性激素水平[5]。此外，有機磷農藥馬拉硫磷還可降低睪丸中支持細胞和間質細胞的數量，而降低T水平[6]。

1.3 擬除蟲菊酯類殺蟲劑的生殖內分泌干擾作用 擬除蟲菊酯類殺蟲劑也可通過下調T合成相關基因(如StAR、P450scc等)的表達而降低T水平。瞿建華[7]發(fā)現，擬除蟲菊酯類殺蟲劑氰戊菊酯抑制類固醇激素合成涉及cAMP/PKA信號通路和IGF信號通路，其機制可能是氰戊菊酯通過抑制cAMP的合成和干擾IGF1表達，繼而抑制StAR和P450scc基因表達。研究顯示，氰戊菊酯還可通過上調下丘腦-垂體-性腺軸中多個基因(如下丘腦GnRH1、垂體AR以及睪丸中AR、ERα等)表達和下調垂體ERβ mRNA表達，從而干擾性腺軸功能[8]。氯氰菊酯可通過激活L型Ca2+通道及抑制內質網Ca2+-ATP酶活性，使細胞質內Ca2+濃度升高，誘導轉錄因子c-Fos、c-Jun、Egr-1表達，繼而上調垂體細胞LH、FSH和CgH基因的表達，最終促進LH、FSH分泌[9]。

1.4 氨基甲酸酯類殺蟲劑的生殖內分泌干擾作用 Meng等[10]研究發(fā)現，滅多威可通過影響雄性羅非魚下丘腦-垂體-性腺軸多個性激素相關基因的表達，如上調下丘腦GnRH2、GnRH3和垂體GnRHR、FSHβ mRNA表達，下調垂體LHβ、精巢AR、3-βHSD mRNA表達，而干擾雄性羅非魚的生殖內分泌功能。岳晴晴[11]研究發(fā)現，呋喃丹可升高雄性斑馬魚機體E2含量，并上調肝臟及性腺雌激素受體(ERs)基因表達，誘導雄性斑馬魚產生卵黃蛋白原，導致其生殖功能損傷。

2 損傷生殖細胞遺傳物質

精子由精原細胞經分裂、增殖、分化、成熟而來。在精子發(fā)生過程中，若生精細胞的遺傳物質受到外源性化學物質干擾，精子的形態(tài)和功能將會受到影響，而這也必然會導致雄性生殖功能的損傷。

2.1 引起雄性生殖細胞DNA損傷 研究顯示，毒死蜱能夠嵌入DNA的螺旋雙鏈，與DNA分子的堿基作用形成嵌合物，使堿基化學結構改變，進而造成DNA損傷[12]。有機磷農藥還可使DNA色素酶A3的嵌入率、核魚精蛋白磷酸化水平和精子頭部磷酸化水平增加，而DNA色素酶A3可與魚精蛋白競爭性結合DNA；同時核魚精蛋白的磷酸化水平增加，使得魚精蛋白與DNA的結合減少，從而引起雄性生殖細胞染色質固縮以及DNA結構完整性的改變[13]。

2.2 引起染色體異常 農藥殺蟲劑也可通過影響雄性生殖細胞染色體的結構和數量而產生雄性生殖毒性。研究表明，有機氯農藥可導致男性精子染色質濃縮以及精液中含Y染色體的精子比例升高[14]。氰戊菊酯能夠增加男性染色體非整倍性頻率和染色體畸變數目，同時提升X、Y染色體和18號染色體二倍性頻率，使精子畸形率升高[15]。因此，農藥殺蟲劑誘導的染色體異常也是其引起雄性生殖障礙的重要機制。

2.3 干擾F0代雄性生殖相關基因的甲基化水平 研究表明，有機氯農藥雙對氯苯基三氯乙烷(DDT)的主要代謝產物p, p′-DDE可引起雄鼠精子細胞Igf2 DMR2基因低甲基化，使雄性仔鼠精子細胞印記基因H19表達上調、Igf2表達下調，導致子代雄性生殖功能損傷[16]。氰戊菊酯可通過干擾F0代精子基因組DNA功能基因CP17A1、NR5A1、PGRC1及生殖相關基因Ace、Foxo3a、Ptgfrn等的甲基化程度，從而影響F1代生殖激素水平及生殖相關指標，對子代的生殖發(fā)育產生負面作用[17]。

3 促進生殖細胞凋亡

細胞凋亡指由一系列基因激活、表達以及調控等作用主導的，為維持內環(huán)境穩(wěn)定的細胞自主有序的死亡。多種蛋白分子和凋亡途徑參與了細胞凋亡，其中主要的蛋白分子家族有4種：Caspase、Bcl-2、adapterproteins和IAPs，凋亡途徑主要有3種：死亡受體途徑、線粒體途徑和內質網途徑。在精子發(fā)生各個階段均存在自發(fā)性的生精細胞凋亡，但過度生殖細胞凋亡會阻礙精子發(fā)生，降低雄性生殖功能。

Guo等[18]發(fā)現，有機氯類殺蟲劑硫丹可通過上調小鼠精原細胞(GC-1spg細胞)p21cip1、p27kip1、p53基因表達，繼而啟動E2F-1介導的細胞凋亡；同時還通過增加Fas/FasL表達，活化Caspase-8、Caspase-3，導致GC-1spg細胞凋亡。任南琪等[19]研究發(fā)現，硫丹還可能通過抑制Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase的活性而升高細胞內Ca2+濃度，導致細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，從而誘導生精細胞凋亡。此外，有機氯類殺蟲劑硫丹也可通過上調睪丸組織CytC表達和下調bcl-2表達來調控生精細胞凋亡[20]。有機磷類殺蟲劑的相關研究顯示，馬拉硫磷可通過影響凋亡調控蛋白bax、bcl-2表達，而促進大鼠睪丸生殖細胞凋亡[21]。對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的研究顯示，氰戊菊酯可通過調控Caspase、Phlda1基因、bcl-2基因家族，而誘導雄性大鼠睪丸中生精細胞的凋亡[22,23]。氨基甲酸酯類殺蟲劑滅多威可上調JNK途徑中MAP3K、MKK4、JNK表達，增強轉錄因子AP-1的作用，促進p53、Bax等促凋亡蛋白表達，從而促使生殖細胞凋亡[24]。

4 誘發(fā)氧化應激反應

在生殖系統各種器官組織中，活性氧(ROS)的產生是一種正常的生理現象，但若ROS生成過多，或者抗氧化酶活性降低，就會引起機體氧化應激反應，進而損害生殖細胞，導致精子產生和成熟障礙。研究發(fā)現，p, p′-DDE可降低超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活力，從而誘發(fā)氧化應激，抑制雄鼠睪丸磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶的表達，激活雄鼠睪丸內生精細胞的線粒體凋亡途徑，阻礙正常精子發(fā)生[25]。Albasher等[26]發(fā)現，有機磷農藥毒死蜱可通過下調Nrf2/ARE通路，而下調超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等的mRNA表達。擬除蟲菊酯類農藥氰戊菊酯可使雄鼠睪丸超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等活力下降，丙二醛含量升高，而導致雄鼠睪丸組織發(fā)生氧化損傷[27]。溴氰菊酯可通過降低雄性睪丸組織抗氧化酶活性、提高NOS活性，導致氧自由基、丙二醛、一氧化氮大量蓄積[28]。

5 干擾生殖系統相關酶的活性

雄性睪丸組織中存在多種與精子發(fā)生相關的酶，如酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脫氫酶(LDH)和γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)等。研究發(fā)現，有機磷殺蟲劑馬拉硫磷可通過抑制睪丸組織LDH、γ-GT和ACP活性，繼而影響睪丸營養(yǎng)物質的運輸、能量供給、T合成以及損傷支持細胞，最終影響精子發(fā)生，導致精子畸形率升高以及精子數量、活力降低[21]。此外，擬除蟲菊酯類農藥及氨基甲酸酯類農藥均可通過影響睪丸組織標志酶ACP、γ-GT、LDH活性，導致雄性生殖功能障礙[29,30]。

6 其他相關機制

除上述作用機制外，農藥殺蟲劑還可以通過擾亂人和動物的生物鐘、干擾雄性生殖細胞的細胞周期以及干擾精子的頂體反應等機制產生雄性生殖毒性。研究顯示，擬除蟲菊酯農藥氰戊菊酯可通過干擾雄性大鼠生殖晝夜節(jié)律性而影響其生殖功能。沈歐璽[31]研究發(fā)現，氰戊菊酯可通過影響microRNA對時鐘基因Bmal1表達的調節(jié)，來干擾Bmal1基因下游的T代謝關鍵酶基因表達，從而表現出對T合成的晝夜時間毒性。路珊珊[32]研究認為，氰戊菊酯可能通過升高Leydig細胞內Ca2+水平，而影響時鐘基因Bmal1、REV-erbα、RORa等的表達和節(jié)律，并最終影響T分泌。

研究發(fā)現，硫丹通過抑制睪丸組織中Sohlh1、Cyclin A1、CDK1、CDK2表達，而引起生殖細胞周期阻滯，導致精子數目下降。進一步研究發(fā)現，PKC-α信號途徑是介導硫丹干擾正常細胞周期的重要機制[33]。此外，農藥殺蟲劑還可干擾精子的頂體反應。研究顯示，氰戊菊酯能夠通過降低精子細胞膜的脂質流動性和抑制T型Ca2+通道電流，從而抑制精子的頂體反應和受精能力[34]。

綜上所述，農藥殺蟲劑對雄性生殖毒性的作用機制是多因素、多途徑的，并且各作用因素、作用途徑之間相互聯系、相互影響。關于農藥殺蟲劑對雄性生殖毒性作用機制的研究，目前主要限于動物實驗，由于實驗動物生殖功能與人類并不完全相同，加之農藥在動物體內的生物轉化及動物實驗暴露劑量、暴露途徑等與人類均有差異，致使動物實驗結果具有很大局限性。同時，隨著農藥配伍使用和混配農藥的大量生產和使用，往往使得接觸農藥的人群體內同時具有多種農藥殘留，而目前就多種農藥殘留對人類生殖健康影響的交互作用的研究還相對較少。因此，農藥殺蟲劑對雄性產生生殖毒性的作用機制還有待進一步全面而深入的研究。