lncRNA H19對乳腺癌細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響及其分子機制

胡鑫，劉劍侖，韋薇，鐘國斌 廣西醫科大學第二附屬醫院，南寧530007； 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院

乳腺癌是危害女性健康的最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有170萬人發生乳腺癌，大約有50萬人死于該病。雖然乳腺癌的診斷和治療已經取得了一定進展，但是其發病率在發展中國家仍逐年升高[1]。因此，進一步探索乳腺癌發生發展的分子機制并尋找用于檢測和治療乳腺癌的新靶標至關重要。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是指長度超過200個核苷酸，不能編碼蛋白質，但具有生物學功能的RNA分子。lncRNA近年已被證實與腫瘤的生物學行為密切相關，參與調控腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[2～4]。lncRNA H19是lncRNA的一種，長度為2.3 kb，位于染色體11p15.5[5]。研究報道，lncRNA H19在胃癌組織和細胞中的表達升高，能夠通過增強NF-κB誘導的炎癥反應促進胃癌細胞侵襲和轉移[6]。2019年6月～2020年6月，本研究觀察了lncRNA H19對乳腺癌細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響，并探討其機制是否與靶向miR-194-5p表達有關。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人乳腺癌細胞系(SKBR3、MDA-MB-453、MCF-7)和正常乳腺上皮細胞系(MCF-10A)均購自美國ATCC細胞庫。主要試劑：培養基、胎牛血清(FBS)及二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Gibco公司，TRIzol、逆轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司，CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所，基質膠Matrigel與Transwell小室購自美國Corning公司，LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司。主要儀器：酶標儀、實時熒光定量PCR儀均購自美國Thermo公司。主要質粒：pcDNA-H19、H19 siRNA、miR-194-5p minic均由上海吉瑪生物科技有限公司合成。

1.2 細胞lncRNA H19表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。選擇生長狀態良好的SKBR3、MDA-MB-453、MCF-7及MCF-10A細胞，采用TRIzol法提取總RNA，根據制造商說明書使用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。lncRNA H19上游引物5′ -GGCAAGAAGCGGGTCTGT-3′，下游引物5′ -GTGCAGCATATTCATTTCCAAG-3′；內參GAPDH上游引物5′ -AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。根據SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明，PCR反應體系20 μL，反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA H19相對表達量。

1.3 細胞分組轉染及轉染效率檢測 將SKBR3細胞以2×105/孔接種于6孔板，37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中進行培養，培養基為含10% FBS的DMEM 高糖培養基。當細胞融合度達75%左右時，收集對數生長期的SKBR3細胞。將SKBR3細胞分為三組，pcDNA-H19組和si-H19組分別采用LipofectamineTM2000轉染試劑說明書轉染pcDNA-H19、H19 siRNA，空白對照組不進行轉染。轉染48 h后收集三組細胞，參照1.2采用實時熒光定量PCR法檢測lncRNA H19表達。

1.4 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。三組細胞以3×103/孔接種于96孔板，將含10% FBS的培養基加入孔板，使每孔液體量達到100 μL，每組設立6個復孔。培養0、24、48、72、96 h，三組分別設置3個復孔，每孔加入10 μL CCK-8試劑；37 ℃、5% CO2培養箱中培養1 h，然后使用酶標儀系統檢測各孔450 nm處光密度(OD)值。實驗重復3次，取平均值。

1.5 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實驗。用無血清培養基以1∶4的比例稀釋Matrigel，以50 μL/孔包被Transwell小室，將小室放入24孔板中，置于37 ℃培養箱中孵育1 h。常規消化三組細胞后用無血清培養基調整細胞密度為2×105/mL，向小室內分別加入三組細胞懸液200 μL，小室下層加入含10 % FBS的完全培養基500 μL。37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h，取出小室，用無菌棉簽擦去上室的細胞，4%多聚甲醛固定下層細胞；1%吉姆薩染色，PBS沖洗3次，干燥后在倒置顯微鏡下對小室下層細胞拍照，隨機選取5個視野，對穿膜細胞計數后取平均值。實驗重復3次，取平均值。

1.6 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。取三組細胞進行常規消化，以3×105/孔接種于6孔板。當細胞基本長滿時，使用20 μL小槍頭垂直背面的直線在6孔板中間劃線。PBS洗滌3次，洗去劃下的細胞，加入2 mL含10%FBS的培養基并拍照(此時記為0 h)。24 h后在相同位置拍照，使用Image J軟件計算三組細胞在0 h與24 h的距離，并計算劃痕愈合率。實驗重復3次，取平均值。

1.7 lncRNA H19對miR-194-5p的調控作用觀察 ①采用雙熒光素酶報告實驗。Starbase2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)軟件預測程序顯示，lncRNA H19和miR-194-5p之間存在連續的結合位點，見圖1。用PCR法擴增lncRNA H19上兩者的結合片段，并將該片段插入到pMIR-REPORT中，構建lncRNA H19野生質粒(H19-wt)，再應用基因突變技術將結合位點突變，獲得lncRNA H19突變質粒(H19-mut)。將SKBR3細胞接種至24孔板中，參照LipofectamineTM2000說明書，將細胞分為四部分，分別進行H19-wt、H19-mut與miR-194-5p mimic、NC mimic共轉染。轉染24 h后，檢測熒光素酶活性，實驗重復3次。②采用實時熒光定量PCR法。取1.3中的三組細胞，參照1.2采用實時熒光定量PCR法檢測細胞miR-194-5p表達，miR-194-5p上游引物5′-GCCGCTGTAACAGCAACTCCAT-3′、下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

圖1 Starbase2.0軟件預測程序顯示lncRNA H19和miR-194-5p之間存在連續的結合位點

2 結果

2.1 乳腺癌細胞與正常乳腺上皮細胞lncRNA H19表達比較 乳腺癌細胞系SKBR3、MDA-MB-453、MCF-7中lncRNA H19相對表達量分別為8.37±1.21、5.62±0.85、3.43±0.96，均高于正常乳腺上皮細胞系MCF-10A中的1.08±0.24(P均<0.01)。其中，SKBR3細胞lncRNA H19相對表達量升高最顯著，故選用SKBR3細胞用于后續實驗。

2.2 三組lncRNA H19表達比較 si-H19組、空白對照組、pcDNA-H19組中lncRNA H19相對表達量分別為0.28±0.08、1.08±0.10、3.04±0.32，三組lncRNA H19相對表達量依次升高(P均<0.01)。

2.3 三組細胞增殖能力比較 培養24、48、72、96 h，si-H19組、空白對照組、pcDNA-H19組相同時間點OD值均依次升高(P均<0.01)。見圖2。

圖2 三組細胞增殖曲線

2.4 三組細胞侵襲、遷移能力比較 si-H19組、空白對照組、pcDNA-H19組穿膜細胞數分別為(31±2)、(65±3)、(102±5)個，劃痕愈合率分別為15.35%±0.88%、31.74%±2.27%、52.18%±2.89%，三組均依次升高(P均<0.01)。

2.5 SKBR3細胞中lncRNA H19與miR-194-5p的相互作用結果 ①雙熒光素酶報告試驗結果:共轉染miR-194-5p mimic+H19-wt或NC mimic+H19-wt的SKBR3細胞熒光素酶活性分別為0.33±0.02、0.97±0.06(P<0.01)，共轉染miR-194-5p mimic+H19-mut或NC mimic+H19-mut的SKBR3細胞熒光素酶活性分別為1.02±0.04、1.06±0.05(P>0.05)；提示lncRNA H19和miR-194-5p之間存在靶向調控關系。②實時熒光定量PCR結果:si-H19組、空白對照組、pcDNA-H19組miR-194-5p相對表達量分別為3.26±0.21、0.98±0.10、0.34±0.06，三組均依次降低(P均<0.01)。

3 討論

人類基因組中70%～90%的基因序列可轉錄為RNA，但是具有編碼蛋白質功能的RNA只有2%，這些不具有編碼蛋白質功能的RNA稱為非編碼RNA(ncRNA)[7]。lncRNA是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子，可通過多種表觀遺傳機制調控基因的表達，對機體產生重要的生物學作用，并與腫瘤發生發展過程密切相關。Qiu等[8]研究發現，lncRNA PVT1能夠通過靶向miRNA-526b/EZH2調控環加速非小細胞肺癌的進展。Li等[9]通過體內、外實驗證實，lncRNA FTX可以促進胃癌細胞增殖、遷移、侵襲以及腫瘤生長，這種作用可以被miR-144抑制。另有文獻報道，在膠質母細胞瘤細胞中過表達lncRNA MATN1-AS1可顯著抑制腫瘤生長[10]。

lncRNA H19是lncRNA中的一員，參與哺乳動物早期胚胎發育，其表達量在組織器官成熟后逐漸下調。近年來研究發現，lncRNA H19表達在多種惡性腫瘤組織中重新上調，對于腫瘤的進展、轉移發揮重要作用。Gao等[11]報道，lncRNA H19在肺腺癌組織中呈高表達，可通過介導肺腺癌細胞上皮間充質轉化促進腫瘤組織的體內外生長。在食管癌中，lncRNA H19在癌組織中表達上調，并通過STAT3/EZH2通路促進食管癌細胞增殖和轉移，同時高表達的lncRNA H19與食管癌患者預后不良密切相關[12]。lncRNA H19還可通過抑制E-cadherin表達而促進膀胱癌細胞轉移，其表達與膀胱癌患者的臨床分期顯著相關[13]。上述結果均表明，lncRNA H19能夠發揮原癌基因作用，但其對乳腺癌細胞生物學功能的影響尚不明確。本研究結果顯示，lncRNA H19在乳腺癌細胞系中的表達明顯升高，提示lncRNA H19可能參與乳腺癌的發生。為進一步明確lncRNA H19對乳腺癌細胞生物學功能的影響，本課題組在SKBR3細胞中干擾lncRNA H19表達，發現細胞增殖、侵襲及遷移能力均減弱；而過表達lncRNA H19后，細胞增殖、侵襲及遷移能力均增強。這表明作為致癌lncRNA的lncRNA H19在乳腺癌的發生和發展中具有重要作用。

研究認為，lncRNA-miRNA功能網絡在乳腺癌的發生進展過程中發揮重要作用[14]。目前，關于lncRNA H19的靶基因及其對乳腺癌致癌的分子機制尚不清楚。本課題組通過Starbase2.0預測程序發現lncRNA H19和miR-194-5p之間存在連續的結合位點。miR-194-5p被認為是一類抑癌基因，可通過增強卵巢癌細胞對紫杉醇化療藥物的敏感性而延緩卵巢癌進展[15]。本研究發現，lncRNA H19過表達能明顯抑制SKBR3細胞miR-194-5p表達，沉默lncRNA H19后miR-194-5p表達升高，提示lncRNA H19可負靶向調控miR-194-5p表達，熒光素酶報告實驗進一步驗證了lncRNA H19與miR-194-5p的靶向調控關系。

綜上所述，乳腺癌細胞lncRNA H19表達升高，lncRNA H19可能通過負靶向調控miR-194-5p而促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移。