嗎啡對人肝癌細(xì)胞Huh7誘導(dǎo)HUVECs血管生成能力的影響及其分子機(jī)制

張志發(fā)，朱夢嬌，周志強(qiáng)，楊少兵 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，武漢430030

阿片類鎮(zhèn)痛藥是緩解腫瘤患者術(shù)后疼痛最常用的藥物，嗎啡作為一種經(jīng)典的阿片類受體激動劑，不僅可以影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲[1, 2]，也可通過刺激腫瘤細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的方式影響腫瘤組織血管生成[3]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是促進(jìn)血管形成的關(guān)鍵分子，也是缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)促進(jìn)組織血管生成的重要靶基因，二者表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，共同調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及無序新生血管生成[4, 5]。研究表明，嗎啡可調(diào)節(jié)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中的HIF-1α表達(dá)[6]，但其是否也可通過HIF-1α介導(dǎo)人肝癌細(xì)胞Huh7的血管生成尚不清楚。2019年1月～2020年5月，本研究觀察了嗎啡對Huh7細(xì)胞誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)血管生成能力的影響，并探討其分子機(jī)制是否與HIF-1α、VEGF有關(guān)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：Huh7細(xì)胞、HUVECs均購自中科院上海細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)研究所。主要試劑：DMEM和胎牛血清均購自美國Hyclon公司，鹽酸嗎啡注射液購自東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司， 乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司，小鼠抗HIF-1α抗體購自美國Novus公司，TRIzol試劑、RIPA裂解液、CCK-8試劑盒均購自美國Sigma公司，Transwell培養(yǎng)板購自美國Corning公司，ELISA檢測試劑盒購自美國Raybiotech公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，Opti-MEM Ⅰ還原型血清培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，內(nèi)參抗體β-actin購自武漢博士德有限公司。HIF-1α小干擾RNA(siHIF-1α)及其陰性對照質(zhì)粒均由廣州銳博生物有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 嗎啡最佳作用濃度及時間篩選 將Huh7細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中添加終濃度為1×105U/L的青-鏈霉素雙抗，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；0.25%胰蛋白酶消化傳代，選用對數(shù)生長期的Huh7細(xì)胞胰酶消化離心，以1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞隨機(jī)分為7部分，分別加入不同濃度嗎啡(0、0.01、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L)作用24 h，對照孔加入不含嗎啡的培養(yǎng)液，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h。用酶標(biāo)儀檢測各孔光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白對照孔OD值)/(對照孔OD值-空白對照孔OD值)×100%。采用乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)檢測嗎啡對細(xì)胞的毒性作用，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，在490 nm波長下讀取各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白對照孔OD值)/(最大釋放對照孔OD值-空白對照孔OD值)×100%。選取最佳濃度后，以該濃度嗎啡分別作用Huh7細(xì)胞0、6、12、24 h，參照上法計(jì)算細(xì)胞增殖率、細(xì)胞毒性，篩選最佳作用時間。

1.3 嗎啡對Huh7細(xì)胞血管生成能力及HIF-1α、VEGF表達(dá)影響的觀察

1.3.1 細(xì)胞分組處理 取對數(shù)生長期的Huh7細(xì)胞，隨機(jī)分為觀察組和對照組，觀察組加入1 μmol/L嗎啡作用24 h，對照組不予特殊處理。

1.3.2 血管形成能力觀察 取兩組細(xì)胞，胰酶消化后轉(zhuǎn)至離心管，室溫條件下800 r/min離心5 min，以1×106/孔接種于6孔培養(yǎng)板中；加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，更換新鮮無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液；繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞上清，將其與ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)液按1∶1體積百分比混合，即為條件培養(yǎng)液。將Matrigel膠置于4 ℃冰箱內(nèi)過夜融化，于預(yù)冷的96孔培養(yǎng)板中鋪置Matrigel膠，每孔50 μL。取對數(shù)生長期的HUVECs，用含10%胎牛血清的ECM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，消化、收集HUVECs后分為兩部分，分別加入上述兩組細(xì)胞的條件培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL。向鋪好Matrigel膠的96孔培養(yǎng)板中每孔加入上述細(xì)胞懸液100 μL，37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)箱中孵育4 h。顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察管腔形成情況，計(jì)數(shù)管腔形成數(shù)量。

1.3.3 細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取兩組細(xì)胞，加入適量的RIPA全裂解液進(jìn)行裂解，提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。在細(xì)胞總蛋白樣品中加入loading buffer，沸水使其充分變性。SDS-PAGE分離蛋白，經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)膜、封閉，加入HIF-1α一抗(稀釋比例為1∶500)及二抗，孵育雜交后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。對條帶進(jìn)行灰度掃描，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算HIF-1α蛋白相對表達(dá)量。

1.3.4 細(xì)胞上清液VEGF表達(dá)檢測 采用ELISA法。收集兩組的細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃保存。采用ELISA法檢測細(xì)胞上清液VEGF表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，主要包括標(biāo)準(zhǔn)品的制備、加樣、孵育、洗滌、顯色，酶標(biāo)儀測定光吸收值，畫標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定濃度。

1.4 HIF-1α沉默對嗎啡作用后Huh7細(xì)胞血管生成能力及HIF-1α、VEGF表達(dá)影響的觀察

1.4.1 細(xì)胞分組處理 取對數(shù)生長期的Huh7細(xì)胞，胰酶消化離心后以2×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁融合率達(dá)40%～50%后，將細(xì)胞分為si-HIF-1α組、si-NC組和空白對照組，si-HIF-1α組、si-NC組分別采用脂質(zhì)體LipofectaminTM2000法轉(zhuǎn)染siHIF-1α及其陰性對照質(zhì)粒，空白對照組不予特殊處理，各組均加入1 μmol/L嗎啡，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4.2 細(xì)胞血管生成能力觀察及HIF-1α、VEGF表達(dá)檢測 參照1.3.2的方法觀察血管形成能力，參照1.3.3、1.3.4的方法檢測細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)及上清液VEGF表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 嗎啡最佳作用濃度及時間篩選結(jié)果 與0、0.01、0.1 μmol/L嗎啡比較，1、10、100 μmol/L嗎啡作用后Huh7細(xì)胞增殖率明顯升高，1 000 μmol/L嗎啡作用后Huh7細(xì)胞增殖率明顯降低(P均<0.05)；與0、0.01、0.1 μmol/L嗎啡比較，1、10、100、1 000 μmol/L嗎啡作用后Huh7細(xì)胞毒性明顯升高，以1 000 μmol/L嗎啡作用后Huh7細(xì)胞毒性升高最明顯(P均<0.05)；見表1。隨著作用時間的延長，1 μmol/L嗎啡作用后Huh7細(xì)胞增殖率及細(xì)胞毒性均明顯升高，以作用24 h升高最明顯(P均<0.05)；見表2。選擇1 μmol/L嗎啡作用24 h為最佳條件。

表1 不同濃度嗎啡作用后Huh7細(xì)胞增殖率、細(xì)胞毒性比較

表2 1 μmol/L嗎啡作用后不同時間點(diǎn)Huh7細(xì)胞增殖率及細(xì)胞毒性比較

2.2 觀察組和對照組管腔形成數(shù)量及HIF-1α、VEGF表達(dá)比較 與對照組比較，觀察組管腔形成數(shù)量及HIF-1α、VEGF表達(dá)均升高(P均<0.05)。見表3。

表3 觀察組和對照組管腔形成數(shù)量及HIF-1α、VEGF表達(dá)比較

2.3 si-HIF-1α組、si-NC組和空白對照組管腔形成數(shù)量及HIF-1α、VEGF表達(dá)比較 與si-NC組、空白對照組比較，si-HIF-1α組管腔形成數(shù)量及HIF-1α、VEGF表達(dá)均降低(P均<0.05)。見表4。

表4 si-HIF-1α組、si-NC組和空白對照組管腔形成數(shù)量及HIF-1α、VEGF表達(dá)比較

3 討論

嗎啡對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響具有雙相性[3,7]，如低濃度(<100 μmol/L)時可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，而高濃度(>1 000 μmol/L)時可抑制腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。既往研究顯示，嗎啡的臨床相關(guān)濃度為2 nmol/L～3.5 μmol/L[8, 9]，而該濃度的嗎啡具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的作用[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L嗎啡作用24 h后可出現(xiàn)細(xì)胞增殖促進(jìn)效應(yīng)；低于100 μmol/L濃度的嗎啡呈時間、劑量依賴性地促進(jìn)Huh7細(xì)胞增殖，但毒性也隨著時間延長而增加；當(dāng)嗎啡濃度增至1 000 μmol/L時，其促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果則因藥物毒性引起的細(xì)胞死亡受到顯著抑制。本研究結(jié)果顯示，1 μmol/L嗎啡作用Huh7細(xì)胞24 h既能滿足毒性最小，又不會影響嗎啡對Huh7細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，因此選擇該條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

HIF-1α是乏氧環(huán)境下介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行適應(yīng)性反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。Koodie等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在乏氧條件下嗎啡可通過抑制HIF-1α蛋白翻譯后修飾的方式影響小鼠新生血管形成。而本研究結(jié)果顯示，在常氧條件下嗎啡也可對Huh7細(xì)胞的HIF-1α表達(dá)產(chǎn)生影響，與Daijo等[6]結(jié)果一致。因此，我們推測嗎啡在常氧條件下影響HIF-1α表達(dá)的分子機(jī)制可能與MAPK信號通路介導(dǎo)的HIF-1α磷酸化有關(guān)[11]。

實(shí)體腫瘤組織內(nèi)新生血管形成是腫瘤快速生長的基礎(chǔ)，新生血管的形成受腫瘤微環(huán)境中多種細(xì)胞因子的調(diào)控，而VEGF是調(diào)節(jié)血管新生過程的重要血管生長調(diào)控因子之一。研究顯示，HIF-1α與VEGF序列上的HRE區(qū)靶向結(jié)合后，通過調(diào)控VEGF表達(dá)而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力[5]。本研究結(jié)果顯示，嗎啡可通過上調(diào)HIF-1α表達(dá)的方式促進(jìn)VEGF分泌，而敲低HIF-1α表達(dá)則可抑制Huh7細(xì)胞分泌VEGF，并逆轉(zhuǎn)嗎啡對HUVECs血管生成能力的促進(jìn)作用，表明VEGF表達(dá)與HIF-1α活性明顯相關(guān)。但Roy等[12]報(bào)道，嗎啡可抑制大鼠心肌細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)。這可能是組織細(xì)胞的來源、實(shí)驗(yàn)條件不同等導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反。另外，雖然本研究證實(shí)嗎啡可通過促進(jìn)Huh7細(xì)胞分泌VEGF的方式影響其血管生成能力，但嗎啡調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的方式不僅僅是上述通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞分泌VEGF的間接方式[6, 13]，其直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)其細(xì)胞增殖的協(xié)同作用也是嗎啡調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞血管生成能力的重要途徑[4]。因此，嗎啡調(diào)控Huh7細(xì)胞血管新生的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，嗎啡可通過激活HIF-1α表達(dá)的方式促進(jìn)Huh7細(xì)胞分泌VEGF，從而促進(jìn)其誘導(dǎo)HUVECs的血管生成能力。