鼻咽癌組織miR-10b與患者臨床病理參數及HoxD4 mRNA表達的關系

劉春麗，郭霞，張潔，梁媛，張圣林承德醫學院附屬醫院，河北承德067000

鼻咽癌是一種發生在鼻咽上皮細胞中的惡性腫瘤，其年齡標準化發病率低于1/100 000，但在我國廣東地區發病率較高[1,2]。miRNA是一類數量繁多、功能復雜的調控因子，廣泛參與多種生命進程的調控。miR-10b為miRNA家族成員之一，在許多惡性腫瘤細胞中均存在異常表達，包括鼻咽癌細胞系[3]，但其在鼻咽癌組織中的表達變化鮮有報道。研究顯示，miR-10b可通過靶向轉錄因子HoxD10促進大腸癌細胞的轉移[4,5]，但二者在鼻咽癌組織中的表達是否相關鮮見報道。因此，本研究觀察了鼻咽癌組織中miR-10b的表達變化，并分析其與患者臨床病理參數及其相鄰基因HoxD4 mRNA表達的關系?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月～2018年6月承德醫學院附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科收治的鼻咽癌患者65例作為觀察組，均未接受過放療、化療或其他生物治療，并經術后病理檢查證實為原發性鼻咽癌，術中收集其癌組織65例份；其中男41例、女24例，年齡(39.57±3.23)歲；組織學類型：角化型38例、非角化型27例；臨床TNM分期[6,7]：Ⅰ期9例、Ⅱ期17例、Ⅲ期31例、Ⅳ期8例；分化程度：高分化鱗狀細胞癌3例、中分化鱗狀細胞癌25例、低分化鱗狀細胞癌22例、未分化癌15例。選擇同期因慢性鼻咽炎進行活檢的患者10例作為對照組，收集其鼻咽正常組織10例份；其中男6例、女4例, 年齡(40.23±3.14)歲。兩組性別、年齡均具有可比性。本研究通過醫院倫理委員會審核，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 鼻咽組織miR-10b表達檢測 采用基于莖環引物的實時熒光定量PCR法。取兩組鼻咽組織，采用TRIzol試劑提取總RNA，紫外分光光度計測量RNA濃度和純度。選擇純度好的組織樣本，使用莖環引物對miR-10b(5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-AGTTGAGCACAAATT-3′)進行逆轉錄，結合成熟miR-10b分子3′側的6個核苷酸，使用特異性引物(5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′)對小核RNA(sn-RNA)U6進行逆轉錄，并將其視為內參。在50 ng總RNA中進行逆轉錄反應，終體積為10 μL，包含特異性引物0.1 pmol、1×反應緩沖液、dNTP 10 nmol和M-MLV逆轉錄酶100 U。將反應物在16 ℃條件下溫育30 min，37 ℃溫育50 min，最后70 ℃溫育15 min終止反應。通過定量PCR儀進行實時熒光定量PCR擴增反應，以U6作為內參。PCR反應體系：RT產物1 μL，每種引物4 pmol，2×Evagreen Master Mix試劑10 μL。PCR反應條件：95 ℃、30 s；94 ℃、10 s，61 ℃、45 s，共45個循環。采用2-ΔΔCt法[8]計算miR-10b相對表達量。

1.3 鼻咽組織HoxD4 mRNA表達檢測 采用熒光定量PCR法。取兩組鼻咽組織，參照1.2的方法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。HoxD4上游引物5′-TGGTCTACCCCTGGATGAAG-3′，下游引物5′-CGACAGACACAGGGTGTGAG-3′，引物長度187 bp；內參U6上游引物5′-TTCGGCAGCACATATACTAAAATTGG-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，引物長度86 bp。PCR反應條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、33 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算HoxD4 mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 兩組鼻咽組織miR-10b、HoxD4 mRNA表達比較及其相關性分析結果 觀察組與對照組鼻咽組織miR-10b相對表達量分別為3.94±0.21、1.25±0.14，兩組比較P<0.05；觀察組與對照組鼻咽組織HoxD4 mRNA相對表達量分別為1.48±0.67、0.98±0.30，兩組比較P>0.05。鼻咽癌組織中miR-10b與HoxD4 mRNA相對表達量無明顯相關性(r=0.038,P>0.05)。

2.2 鼻咽癌患者不同臨床病理參數間鼻咽癌組織miR-10b表達比較 患者年齡<30歲、臨床TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、T分期為T3～T4期的鼻咽癌組織miR-10b表達均高于患者年齡≥30歲、臨床TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、T分期為T1～T2期的鼻咽癌組織(P均<0.05)。不同性別、組織學類型、N分期、M分期、分化程度的鼻咽癌組織miR-10b表達比較均無統計學差異(P均>0.05)。見表1。

3 討論

Gee等[9]使用芯片技術發現，除鼻咽癌以外的其他頭頸部惡性腫瘤患者中均存在miR-10b表達下調。本研究結果顯示，觀察組鼻咽組織miR-10b表達明顯高于對照組，說明原發性鼻咽癌組織中miR-10b顯著過表達，提示miR-10b可能與鼻咽癌的發生發展有關。本研究分析鼻咽癌組織miR-10b表達與患者臨床病理參數的關系時發現，年齡<30歲(青年型)的鼻咽癌患者癌組織miR-10b表達高于≥30歲者，說明青年型患者可能具有獨特的致癌途徑及臨床和生物學特征。既往研究顯示，青年型鼻咽癌患者中控制細胞凋亡存活平衡的兩種關鍵蛋白p53和Bcl-2表達較少，IgA抗EA和抗VCA抗體較少[10]，而C-kit受體和EBV癌蛋白LMP1較多[11]。這可能是導致青年型鼻咽癌患者miR-10b升高的原因之一，但具體機制還需要進一步研究。Sun等[12]在鼻咽癌CN-2Z細胞系中發現，miR-10b過表達可以促進鼻咽癌細胞的遷移和侵襲，提示miR-10b表達與淋巴結和(或)遠處轉移有關。但本研究結果顯示，是否發生淋巴結和(或)遠處轉移的鼻咽癌組織miR-10b表達無統計學差異，而臨床TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、T分期為T3～T4期的鼻咽癌組織miR-10b表達均高于臨床TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、T分期為T1～T2期的鼻咽癌組織；這說明miR-10b過表達可能參與的是癌細胞的增殖過程，而不是遷移和侵襲過程。

表1 鼻咽癌患者不同臨床病理參數間鼻咽癌組織miR-10b表達比較

miROB在線數據庫(http://mirob.interactome.ru/microRNA_databases)顯示，miR-10b主要通過靶向不同基因，進而控制各種不同的細胞途徑，其中研究最多的是細胞周期抑制基因和促凋亡基因，如BCL2L11、TFAP2C、CDKN1A、CDKN2A、TP53、CYLD和FOXO3等。關于miR-10b是否通過過表達HOXD4基因而參與鼻咽癌的發生、發展及轉移，目前的研究結果仍存在爭議。一項乳腺癌相關的研究顯示，miR-10b表達升高可能是因為miR-10b基因也嵌入在HOXD4基因上游1 kb染色體2q31上的HOXD簇中，即這兩個基因共享位于miR-10b上游1.5 kb的共同調節區內(包含RARE元件)[13]。還有研究證明，抑制miR-10b表達可以同時抑制神經母細胞瘤組織HoxD4的表達[14]。Kim等[15]研究顯示，由于受DNA控制區域CpG島高甲基化的影響，胃癌細胞中miR-10b和HoxD4的表達可出現同時抑制現象。但本研究結果顯示，觀察組和對照組鼻咽組織HoxD4 mRNA表達比較無統計學差異，且鼻咽癌組織中miR-10b和HoxD4 mRNA表達無明顯相關性，提示兩個基因受到的調控途徑可能不同。因此,miR-10b在鼻咽癌發生中的作用機制還需要進一步研究。

綜上所述，鼻咽癌組織miR-10b表達升高，miR-10b表達與患者的年齡、TNM分期及T分期有關，與HoxD4 mRNA表達無關。