PCOS患者血清中VEGF表達及與VEGF基因位點rs2010963G/C多態(tài)性遺傳易感性分析

朱春仁 劉愛勝 何廣營 張 燕

(深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，深圳 518109)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是以月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)、無排卵及不孕等為主要臨床表現(xiàn)的一種育齡婦女常見的內(nèi)分泌紊亂性代謝疾病，其發(fā)病率為5%～10%。PCOS患者除有多毛、痤瘡及肥胖等高雄激素血癥和卵巢多囊性特征外，還常伴有胰島素抵抗和2型糖尿病等代謝綜合征[1-3]。PCOS發(fā)病與多種因素有關(guān)，但至今為止，其發(fā)病機制尚未闡明。有研究表明，PCOS 是一種復雜的多基因遺傳性疾病，與人體內(nèi)多種基因位點突變有關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種有效的血管生成因子和細胞內(nèi)皮分裂原，是促進血管生成和增加血管通透性的重要因子之一。有關(guān)研究表明，VEGF濃度在PCOS患者血清中明顯升高，且VEGF基因在PCOS患者卵巢基質(zhì)中也呈高度表達，表明VEGF基因在PCOS的病理生理學中起重要的作用，同時不同地區(qū)和種族人群因遺傳背景和環(huán)境的不同，會導致基因突變存在一定的區(qū)域性和種族性差異[4-7]。為此，本研究對深圳市龍華區(qū)109例PCOS患者血清中VEGF表達及其位點rs2010963G/C基因多態(tài)性進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 收集2017年3月～2019年3月醫(yī)院門診婦科就診并確診為PCOS患者109例，年齡18～42歲，平均年齡(29.26±12.73)歲。PCOS患者診斷參照美國生殖醫(yī)學學會(ASRM)鹿特丹工作組修正的診斷標準[8]：①稀發(fā)排卵或無排卵；②臨床或生化有高雄激素血癥的表現(xiàn)；③經(jīng)陰道超聲檢查有多囊性卵巢(每個卵巢的直徑為2～9 mm，且存在≥12個卵泡或卵巢體積≥10 ml)，符合其中2項或以上才能診斷為 PCOS，并排除先天性腎上腺增生、高泌乳素血癥和雄性激素分泌型腫瘤等疾病。選擇同時期來院體檢的健康育齡婦女120例，年齡19～40歲，平均年齡(28.72±11.67)歲，均有正常的月經(jīng)周期和至少1次成功的懷孕史，且沒有任何內(nèi)分泌紊亂疾病和糖尿病家族史，超聲檢查未見多囊性卵巢。兩組研究對象3個月內(nèi)均無激素治療史，且均無內(nèi)外科及其他疾病史，兩組研究對象的一般性資料之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會同意批準，且所有研究對象知情同意。

1.1.2儀器與試劑 ABI7500 PCR基因擴增儀由美國ABI公司提供；DNA提取試劑由深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供；VEGF試劑盒由上?？道噬锟萍加邢薰咎峁?；AE275全自動酶聯(lián)免疫分析儀由深圳愛康科技有限公司提供。

1.2方法

1.2.1標本采集 于清晨空腹采集靜脈血4～5 ml，其中2 ml加入EDTA-K2一次性抗凝管內(nèi)混勻，用于VEGF基因位點rs2010963G/C多態(tài)性分析，其余加入一次性無抗凝劑干燥管內(nèi)，室溫靜置30 min后離心分離血清用于VEGF水平檢測。

1.2.2VEGF水平檢測 采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清中VEGF水平，所有操作嚴格按儀器和試劑盒說明書及科室SOP操作規(guī)程，并在同等條件下進行，確保兩組VEGF水平檢測結(jié)果的準確性和可比性。

1.2.3DNA提取 采用DNA提取試劑盒提取全血中DNA，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行，DNA提取完成后通過電泳檢測其是否完整，并采用紫外分光光度儀檢測其濃度以及純度，合格后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4多態(tài)性分析 ①引物設計：上游引物：5′-AGAGACGGGGTCAGAGAGAG-3′，下游引物：5′-TCCGGCGGTCACCCCCAAAA-3′。②PCR擴增體系：反應總體積為15 μl，其中模板DNA 0.5 μl，10×PCR緩沖液1.5 μl，5 U/μl耐熱DNA聚合酶0.1 μl，10 mmol/L dNTP 0.3 μl，50 pmol/μl的上、下游引物各0.2 μl，25 mmol/L MgCl21.2 μl，dH2O 11 μl。③PCR擴增條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，68℃退火45 s，72℃延伸60 s，共循環(huán)20次，最后72℃延伸6 min。④電泳：酶切反應體積為15 μl，其中PCR擴增產(chǎn)物10 μl，10 U/μl限制性內(nèi)切酶0.1 μl，混勻于37℃水浴箱內(nèi)過夜，然后于30 g/L的瓊脂糖凝膠內(nèi)150 V電泳30 min，分析其基因型。

2 結(jié)果

2.1兩組血清中VEGF水平比較 PCOS組患者血清中VEGF水平為(185.29±37.60)pg/ml，明顯高于對照組的(91.07±23.56)pg/ml，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.402 7，P<0.05)。

2.2VEGF位點rs2010963G/C基因單核苷酸多態(tài)性比較 PCOS患者血清中VEGF位點rs2010963G/C的GG基因型及G等位基因檢出率分別為54.13%和66.97%， 明顯高于對照組的29.17%和44.58%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.790 5～4.520 9，P<0.05)，結(jié)果見表1。

表1 PCOS組和對照組血清中VEGF位點rs2010963G/C基因多態(tài)性比較[例(%)]Tab.1 Comparison of polymorphism of VEGF locus rs2010963G/C in serum between PCOS group and control group[n(%)]

2.3電泳分析 經(jīng)PCR擴增后可獲得145 bp大小的目的片段，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳VEGF基因位點rs2010963分別于145、107及38 bp處顯色檢出CC、GC及GG 3種基因型條帶，結(jié)果見圖1。

圖1 VEGF基因位點rs2010963擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis results of amplification product of VEGF gene rs2010963Note:M.Marker;1，2，4，5，6，7 were GC genotypes.3 was CC genotype;8 was GG genotype.

2.4PCR擴增產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果 對部分抽樣PCR擴增產(chǎn)物進行基因測序，結(jié)果見圖2。

圖2 VEGF基因位點rs2010963多態(tài)性測序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of VEGF gene locus rs2010963 polymorphism

2.5不同基因型PCOS患者血清中VEGF水平比較 GG基因型PCOS患者血清中VEGF水平為(278.35±51.02)pg/ml，明顯高于GC和CC基因型(206.18±40.95和142.73±29.86)pg/ml，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.918 2～6.074 3，P<0.05)。

3 討論

PCOS是一種涉及生殖、內(nèi)分泌和代謝等多系統(tǒng)的復雜性疾病，具有高度異質(zhì)性和病因復雜性的特點，主要表現(xiàn)為高雄激素血癥、稀發(fā)排卵或無排卵、胰島素抵抗及卵巢多囊樣改變，是無排卵性不孕的主要原因。若PCOS病情不控制任其長期發(fā)展，患者將伴發(fā)糖尿病、高血壓、高血脂及心血管疾病等多種代謝相關(guān)性疾病，給育齡婦女的生理、心理、經(jīng)濟和生活均造成極大的影響[5,9]。PCOS發(fā)病機理目前尚未完全闡明，但多數(shù)研究者認為，PCOS發(fā)病是致病基因位點突變與環(huán)境因素共同作用所導致的[10-12]。因此，加強PCOS發(fā)病機制研究，對PCOS患者的診斷、治療及預防具有重要意義。

VEGF是由多數(shù)腫瘤細胞、傷口中角質(zhì)細胞及巨噬細胞所產(chǎn)生的一種有效的血管生成因子和細胞內(nèi)皮分裂原，是促進血管生成和增加血管通透性的重要因子之一。有研究表明，PCOS患者血清中VEGF水平明顯升高[7，13]。本研究結(jié)果顯示，深圳龍華區(qū)PCOS患者血清中VEGF水平明顯高于對照組健康育齡婦女，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與有關(guān)文獻報道相一致[7,13]。這可能與VEGF促進卵巢內(nèi)膜微血管新生和增加其通透性有關(guān)，從而引起卵巢基質(zhì)細胞的異常生長，使得卵泡內(nèi)膜細胞產(chǎn)生大量的雄性激素與VEGF維持卵巢濾泡周圍血流和調(diào)節(jié)濾泡內(nèi)氧濃度等，具體機制有待進一步研究。

PCOS發(fā)病是遺傳和環(huán)境因素共同作用所引起的，其中遺傳因素在PCOS發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[14]。研究表明，PCOS發(fā)病與多種基因位點突變有關(guān)，且不同地區(qū)和種族人群因遺傳背景和環(huán)境因素的不同可能導致結(jié)果不一致[15，16]。VEGF基因位于人類6號染色體的短臂2區(qū)1帶3亞帶，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，是一種肝素結(jié)合糖蛋白。有關(guān)文獻表明，VEGF基因突變與PCOS發(fā)生和發(fā)展有密切相關(guān)性，且不同地區(qū)和種族人群VEGF基因突變結(jié)果存在一定差異[17，18]，如Vural等[19]報道VEGF基因位點rs2010963G/C突變與土耳其PCOS患者之間無密切相關(guān)性，而黃茜等[13]報道的我國河北地區(qū)及Guruvaiah 等[20]報道南印度地區(qū)VEGF基因位點rs2010963G/C突變與PCOS患者之間密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，深圳龍華區(qū)PCOS患者血清中VEGF基因位點rs2010963G/C多態(tài)性以GG基因型及G等位基因檢出率最高，明顯高于GC、CC基因型及C等位基因，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與有關(guān)文獻研究的結(jié)果之間存在一定的差異，表明不同地區(qū)和種族人群之間基因突變的差異性[7,13，19，20]。因此，SNP位點突變相關(guān)研究應充分考慮研究對象的地域性和種族差異性，使研究結(jié)果更可靠、更具有代表性[20，21]。本研究結(jié)果還顯示，VEGF基因位點rs2010963G/C GG基因型PCOS患者血清中VEGF水平明顯高于GC和CC基因型，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這與VEGF基因啟動子區(qū)的 SNP 位點可能通過改變轉(zhuǎn)錄因子和基因啟動子的結(jié)合作用，進而調(diào)節(jié)VEGF 基因的表達水平有關(guān)。

綜上所述，PCOS患者血清中VEGF水平明顯升高，VEGF基因位點rs2010963G/C分布呈多態(tài)性，不同基因型PCOS患者血清中VEGF水平存在很大差異，且具有地域性和種族性。因此，加強不同地區(qū)和種族人群VEGF水平及其相關(guān)基因位點多態(tài)性分析，對PCOS患者的診斷、治療及預防具有十分重要的意義。