多指標綜合加權評分法優(yōu)選復方夏枯草洗劑提取工藝研究*

陸雪琴 ，趙 亮 ，周 潔 ，段彥娟 ，張春燕 ，朱建勇 ，翟曉翔 ，2

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院皮膚科，上海 200137；2.南京中醫(yī)藥大學，南京 210023；3.上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院中心實驗室，上海 200137）

復方夏枯草洗劑處方由夏枯草、丹參、威靈仙、木賊、板藍根、大青葉、皂角刺、鴨跖草、薏苡仁、制香附共10味中藥組成，為上海市第七人民醫(yī)院皮膚科臨床驗方。該復方中藥外用治療尋常疣具有臨床療效好、對皮膚無刺激性的優(yōu)點，可以極大提高患者、尤其兒童的順應性，減輕痛苦，提高療效。本研究旨在按照國家食品藥品監(jiān)督管理總局對醫(yī)療機構應用傳統(tǒng)工藝配制中藥制劑的要求，擬將復方夏枯草洗劑研制成院內制劑，使該制劑規(guī)范化應用于臨床，保證藥物的安全性、穩(wěn)定性、有效性和可控性。本研究采用正交實驗設計，以迷迭香酸、丹酚酸B的含量及出膏率為考察指標[1-2]，對料液比、提取時間、提取次數(shù)等因素進行考察，優(yōu)選復方夏枯草洗劑的最佳提取工藝，確保該藥物的工藝穩(wěn)定，質量可控[3-4]。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（Agilent 1260），美國安捷倫公司；電子天平（CP225D），北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；超聲清洗儀（DL720-A），上海之信儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀（N-1300-WB），日本EYELA公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS28型），上海一恒科學實驗有限公司；電熱恒溫干燥箱（DNG-9140A），上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 藥物與試劑 對照品迷迭香酸（批號：111871-201706）、丹酚酸 B（批號：111562-201716），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純試劑，美國Fisher公司；水為超純水，其余試劑均為分析純。夏枯草等10味藥材均購自上海康橋藥業(yè)有限公司，符合2015版《中華人民共和國藥典》相關規(guī)定。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以0.1%磷酸溶液為流動相A，以甲醇為流動相B，洗脫程序見表 1；流速：1.0 mL/min；柱溫：28.0 ℃；檢測波長：286 nm；進樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取迷迭香酸、丹酚酸B對照品適量，加50%甲醇溶液溶解，配制成濃度分別為 115 μg/mL，1 700 μg/mL 混合對照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取1日處方量藥材共155 g，加10倍量水，煎煮2次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮至100 mL，精密吸取1 mL濃縮液，置5 mL的容量瓶中，加50%甲醇溶液定容至5 mL，即得。

2.1.4 陰性對照品溶液的制備 稱取除夏枯草、生丹參之外的藥材，按照“2.1.3”項下方法，制備缺夏枯草、生丹參的陰性對照溶液。

2.2 迷迭香酸、丹酚酸B專屬性實驗 分別吸取混合對照品溶液，供試品溶液，陰性對照品溶液各10 μL，按“2.1.1”項下進行分析，2 種指標性成分與其相鄰的色譜峰分離系數(shù)均大于1.5，并且各組分互不干擾，理論塔板數(shù)符合要求，陰性無干擾，專屬性良好。見圖1。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密吸取 1、2.5、5、10、12.5、15、20 μL的混合對照品溶液，注入液相色譜儀，按照“2.1.1”項下的方法進行測定，記錄峰面積。以進樣量為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得各組分線性方程、相關系數(shù)、線性范圍分別為Y迷迭香酸=674.85X-2.427 7，r=1.000 0，0.115～2.3 μg；Y丹酚酸B=319.26X-7.741 6，r=1.000 0，1.7～34 μg，在相應進樣范圍內線性關系良好。

2.3.2 精密度實驗 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液 5 μL，按“2.1.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積，計算迷迭香酸、丹酚酸B的RSD分別為0.31%、0.22%，表明儀器的精密度良好。

2.3.3 重復性實驗 按“2.1.3”項下的方法分別制備6份供試品溶液，分別進樣10 μL，記錄迷迭香酸、丹酚酸B的峰面積，計算迷迭香酸、丹酚酸B的RSD分別為0.53%、0.59%，表明方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實驗 取“2.1.3”項下方法配制供試品溶液，分別于室溫放置 0、2、4、8、16、32 h。按“2.1.1”項下色譜條件進樣 10 μL，測定峰面積，計算迷迭香酸、丹酚酸B的RSD分別為1.24%、0.54%，表明供試品溶液在32 h內穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率實驗 取已知指標成分含量的供試品溶液1份，在線性范周內分別加入一定量的迷迭香酸、丹酚酸 B 對照品溶液，各 6 份，按“2.1.1”項下色譜條件測定含量，結果見表2。迷迭香酸和丹酚酸B的平均回收率為101.6%和97.3%，RSD分別為2.16%和1.89%，說明本方法回收率良好。

2.4 單因素實驗

2.4.1 料液比對提取率的影響 稱取1日處方量藥材，約155 g，共6份，補足吸水量，料液比分別按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 和 1∶14 煎煮 1 次，每次 0.5 h，煎液濃縮至 100 mL。按“2.1.3”項下方法分別配制迷迭香酸、丹酚酸 B 的供試品溶液。按“2.1.1”項下方法進行含量測定，結果見表 3。實驗顯示，1∶4、1∶6 提取兩種主成分含量偏低，1∶14提取兩種主成分提高不明顯，經選擇選取 1∶8、1∶10 和 1∶12 為正交實驗料液比進一步考察。

2.4.2 提取時間對提取率的影響 稱取1日處方量藥材，約155 g，共5份，補足吸水量，加10倍水，煎煮 1 次，分別煎煮 0.5、1、1.5、2、2.5 h，煎液濃縮至100 mL。按“2.1.3”項下方法分別配制迷迭香酸、丹酚酸B的供試品溶液。按“2.1.1”項下方法進行含量測定，結果見表4。實驗顯示，兩種主成分含量隨煎煮時間的增加有明顯的下降趨勢，所以選擇0.5、1、1.5 h為正交實驗提取時間進一步考察。

圖1 復方夏枯草洗劑的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Compound Xiakucao Lotion

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

表2 加樣回收率實驗結果Tab.2 Results of recovery test

表3 料液比對提取率的影響結果（n=3）Tab.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield(n=3)mg/mL

2.5 正交實驗

2.5.1 正交實驗設計 以復方夏枯草洗劑處方藥材濃縮提取液中迷迭香酸、丹酚酸B的含量及干膏得率為指標，采用L9（34）正交實驗進行考察料液比，提取時間，提取次數(shù)等因素，優(yōu)選出最佳的提取工藝，因素水平見表5。

2.5.2 正交實驗方案 按照“2.1.3”項下的方法，對正交設計各組的方案進行提取，制備各組供試品溶液，按照“2.1.1”項下的色譜條件進行含量測定，記錄峰面積，計算各供試品溶液中迷迭香酸、丹酚酸B的含量，結果見表6。

表4 提取時間對提取率的影響結果（n=3）Tab.4 Effect of extraction time on extraction yield(n=3)mg/mL

表5 正交實驗因素水平表Tab.5 Orthogonal experiment factor level table

2.5.3 干膏得率的測定 精密量取各組濃縮提取液25 mL，分別置已干燥至恒質量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置105℃的烘箱中干燥至恒質量，取出，置干燥器中冷卻后，迅速稱定質量，計算出膏率，結果見表6。

2.5.4 正交實驗結果分析 根據(jù)指標因素對提取工藝影響貢獻的大小的差異分配權重系數(shù)，復方夏枯草洗劑由夏枯草、生丹參、威靈仙、木賊等10味藥組成，夏枯草與生丹參為君藥，分別選取兩味藥材的主成分迷迭香酸和丹酚酸B為定量質控指標；干浸膏收率也可反應本方中有效成分的提取效率，故也選定為考察指標，并給予相應權重系數(shù)。即迷迭香酸含量（W1）的權重系數(shù)為0.4，丹酚酸B含量（W2）的權重系數(shù)為 0.4，干浸膏收率（W3）的權重系數(shù)率為 0.2 進行加權求和[2]，綜合評分 W（%）=0.4W1/Wmax1+0.4W2/Wmax2+0.2W3/Wmax3。綜合加權評價結果見表9和表10。

由表7中結果分析可知，料液比和提取時間對提取效果無顯著影響。各因素對綜合評分的影響依次為 C＞B＞A，最優(yōu)提取工藝為 C3B1A1，即 1∶8，0.5 h，3次。最后確定最佳提取工藝為加8倍水，煎煮0.5h，提取3次。

2.6 驗證實驗 稱取1日處方量藥材，共3份，按照確定的最佳提取工藝C3B1A1進行驗證實驗，即加入8倍量的水，提取3次，每次0.5 h，提取液合并濃縮至 100 mL，按照“2.1.3”項下的方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下方法測定迷迭香酸、丹酚酸 B的含量。實驗結果見表8，綜合評分值達113.21%～114.12%，結果顯示，該工藝準確可靠，可行性好，可用于工業(yè)化生產。

表6 復方夏枯草洗劑提取工藝的L9（34）正交實驗設計與結果（n=3）Tab.6 L9(34)orthogonal design and results of optimizing extraction process for Compound Xiakucao Lotion(n=3)

表7 方差分析表Tab.7 Analysis of variance table

表8 驗證實驗結果Tab.8 Verify experimental results

3 討論

復方夏枯草洗劑中的君藥為夏枯草和生丹參，結合文獻資料，本文選用夏枯草、生丹參中主要成分迷迭香酸和丹酚酸B作為含量檢測指標[1-2]，其含量測定方法主要參考《中華人民共和國藥典》2015年版（一部）相關藥材項下含量測定方法[5]，2種指標性成分的檢測波長藥典中分別為330 nm和286 nm[5]，經過實驗發(fā)現(xiàn)采用波長286 nm，能很好地同時檢測到兩味藥材中主成分的含量，故采用此波長來檢測復方夏枯草洗劑樣品，同時結合相關文獻[6-8]進行制定。

尋常疣是一種發(fā)生于皮膚淺表的慢性良性贅生物，由人類乳頭瘤病毒（HPV）感染引起[9]。作為皮膚病門診中最常見的皮膚病之一，尋常疣雖然易于診斷，但由于可自身接種，臨床上治療非常棘手，復發(fā)率居高不下，對患者的生活質量造成極大的影響。目前，臨床上尚無特異性抗病毒藥物可用于HPV感染，尋常疣有較多的治療方法，主要包括有兩類手段，一類是使用物理或化學方式直接損壞表皮的疣體，另一類是使用免疫調節(jié)劑改善人體的細胞免疫功能[10]。前者屬于有創(chuàng)治療，存在諸多弊端，如治療過程較為痛苦、容易形成創(chuàng)面、恢復周期長、容易感染等，并且有著較高的復發(fā)率。而使用免疫調節(jié)劑的有效率不佳，患者面臨較高的治療成本和時間成本。中藥外用治療尋常疣有一定的優(yōu)勢，具有毒副作用小、費用低廉、療效顯著等特點，應借助現(xiàn)代科學實驗技術進一步深入研究。

復方夏枯草洗劑為上海市第七人民醫(yī)院皮膚科的經驗方，前期臨床研究結果表明復方夏枯草洗劑能夠有效減輕尋常疣的角質增生與炎癥反應，療效顯著。本研究采用多指標綜合加權評分法優(yōu)選復方夏枯草洗劑提取工藝，確定最佳提取方法，為復方夏枯草洗劑的開發(fā)提供完備的實驗基礎，使其作為院內制劑更規(guī)范化應用于臨床。