阿米洛利對α2C腎上腺素受體別構(gòu)調(diào)節(jié)作用的研究#

張蕭蕭 劉若凡 劉麗艷 黃寧 陳軍利

（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，四川 成都 610041）

α2腎上腺素受體（α2-adrenergic receptor,α2-AR）是G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptors，GPCRs）超家族成員，屬于A類（視紫紅質(zhì)類）GPCR受體，有α2A、α2B、α2C三種亞型[1,2]，主要在內(nèi)源性兒茶酚胺、腎上腺素和去甲腎上腺素發(fā)生內(nèi)源性生物學(xué)效應(yīng)方面具有重要作用。其中α2C-AR主要參與一些神經(jīng)系統(tǒng)障礙性疾病（如抑郁癥、精神分裂癥以及認(rèn)知障礙等）的發(fā)生發(fā)展的過程[3,4]。因此，α2C-AR可能是治療上述疾病的潛在藥物靶點(diǎn)。

與傳統(tǒng)的正性藥物相比，別構(gòu)調(diào)節(jié)劑具有副作用小、選擇性高以及不影響內(nèi)源性受體的正常生理學(xué)信號傳導(dǎo)模式等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的潛在藥物開發(fā)前景[5,6]。研究顯示，阿米洛利及其類似物（如Benzamil）是多種GPCR家族受體的別構(gòu)調(diào)節(jié)劑[7,8]，但是否對α2C-AR具有別構(gòu)調(diào)節(jié)效應(yīng)，目前尚未見報道。

本文主要是利用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計手段和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)來檢測阿米洛利和Benzamil與α2C-AR的潛在結(jié)合位點(diǎn)及其別構(gòu)調(diào)節(jié)作用，為研發(fā)新型α2C-AR別構(gòu)調(diào)節(jié)劑打下結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

COS-7細(xì)胞（ATCC），DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone），F(xiàn)BS（Gibco）,青霉素-鏈霉素溶液（Biosharp），PBS（HyClone），3H-RX821002（PerkinElmer），PEI40000（Polysciences），BCA試劑盒（碧云天），15 cm培養(yǎng)皿（NEST）。

1.2 方法

1.2.1 α2C-AR晶體結(jié)構(gòu)補(bǔ)全

應(yīng)用Accelrys Discovery Studio Client version 3.1 (Accelrys Software Inc.USA)，打開所需補(bǔ)全的α2C-AR的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID:6KUW），在Protein Report中顯示所缺失的氨基酸序列，在Hierarchy View中選中所缺失的序列，并填入缺失氨基酸的序列。

1.2.2 分子對接

在Discovery Studio 3.1軟件中，對α2C-AR進(jìn)行加氫，從“from receptor cavity” 定義結(jié)合口袋。應(yīng)用CDOCKER對配體和受體進(jìn)行分子對接，Tophit設(shè)置為10，Pose Cluster Radius為0.5，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

1.2.3 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d進(jìn)行細(xì)胞鋪板，以保證轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度為60%-70%。轉(zhuǎn)染前1 h，將細(xì)胞培養(yǎng)液換為不含血清、雙抗的DMEM培養(yǎng)基。將質(zhì)粒DNA和PEI40000按1:3比例分別加入不含血清、雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，混勻室溫放置5 min，再將質(zhì)粒和PEI混合并混勻，室溫孵育15 min。向培養(yǎng)皿中加入混合后的轉(zhuǎn)染試劑，37℃孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，加入含血清、雙抗的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48-72 h后提取膜蛋白。

1.2.4 膜蛋白提取

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用10 ml的4℃PBS清洗兩次，加入10 ml PBS刮下細(xì)胞，4℃，800g離心5 min，棄上清。加入20 ml HEPES buffer，用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，24000 rpm離心10 s，反復(fù)進(jìn)行3次，每次間隔10 s，4℃1300 g離心10 min。吸取上清液至超高速離心管中，4℃100000 g離心1 h，棄上清。加入含10%甘油的HEM溶液，并用1 ml胰島素注射器反復(fù)吹打15-20次，充分混勻后，每管50 μl分裝，置于-80℃保存待用。應(yīng)用BCA法對蛋白濃度進(jìn)行測定。

1.2.5 受體表達(dá)實(shí)驗(yàn)

將不同濃度的膜蛋白與3.5 nM的3HRX821002共孵育1 h，加入4℃PBS終止反應(yīng)，GF／B濾膜過濾，通過液體閃爍儀對樣品放射性進(jìn)行測定。加入100 μM酚妥拉明來檢測非特異性結(jié)合。

1.2.6 解離動力學(xué)實(shí)驗(yàn)

在不同時間點(diǎn)，將含有α2C-AR的膜蛋白加入到含有3.5 nM3H-RX821002的HEM 緩沖液中，室溫孵育1 h，在不同時間點(diǎn)加入100 μM酚妥拉明10 μL和Amiloride/Benzamil 10 μL（實(shí)驗(yàn)組），或100 μM 酚妥拉明10 μL（對照組）。加入4℃PBS終止反應(yīng)，GF／B濾膜過濾，通過液體閃爍儀對樣品放射性進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 α2C-AR晶體結(jié)構(gòu)及其質(zhì)量檢測

在Discovery Studio3.1軟件中打開α2C-AR的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID:6KUW），可查見該蛋白Leu190到Ala197位氨基酸缺失，見圖1A，插入缺失的氨基酸之后的結(jié)構(gòu)如1B所示。酚妥拉明是α2-AR的阻滯劑，去甲腎上腺素是α2-AR的激動劑，我們采用CDOCKER將這兩種化合物分別與α2C-AR進(jìn)行分子對接，然后從對接模式最集中的簇中，選評分最高的對接模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，這兩種化合物均位于α2C-AR的胞內(nèi)端，且均與Val236和Thr241形成氫鍵，提示Val236和Thr241可能是該兩種化合物與α2C-AR的結(jié)合位點(diǎn)，見圖1C和圖1D。

2.2 阿米洛利及Benzamil與α2C-AR作用位點(diǎn)預(yù)測

為預(yù)測阿米洛利和Benzamil與α2C-AR的作用位點(diǎn)，我們采用CDOCKER將阿米洛利和Benzamil與α2C-AR進(jìn)行分子對接。分子對接后產(chǎn)生10個對接模式，從對接模式最集中的簇中，選評分最高的對接模式分析。結(jié)果顯示，與酚妥拉明和去甲腎上腺素相似，阿米洛利和Benzamil均位于α2C-AR的胞內(nèi)端，其中阿米洛利與Glu377和Phe380形成氫鍵，見圖2A，Benzamil與Asn160和Thr241形成氫鍵，見圖2B。

圖1 α2C-AR晶體結(jié)構(gòu)及酚妥拉明和去甲腎上腺素分子對接

圖2 阿米洛利、Benzamil與α2C-AR 分子對接

2.3 α2C-AR表達(dá)量檢測

通過測定α2C-AR表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，α2C-AR表達(dá)呈劑量依賴性，見圖3，后續(xù)將選取5-10 μg的含有α2C-AR的膜蛋白進(jìn)行解離實(shí)驗(yàn)。

圖3 α2C-AR 表達(dá)

2.4 阿米洛利與Benzamil對3H-RX821002解離速度的影響

阿米洛利與對照組的HalfLife值分別為0.8710和0.9314，見圖4A；Benzamil與對照組的HalfLife值為1.003和1.206，見圖4B，阿米洛利與Benzamil對3H-RX821002的解離速度均無影響。

圖4 阿米洛利（A）和Benzamil（B）對3H-RX821002解離速度的影響

3 討論

α2C-AR是GPCR超家族一員，參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程，提示α2C-AR可能是這些疾病的潛在藥物靶點(diǎn)。與作用于正性結(jié)合位點(diǎn)的化合物相比，別構(gòu)調(diào)節(jié)劑具有副作用小、選擇性高，且不影響受體信號傳導(dǎo)模式等一系列優(yōu)點(diǎn)。目前，多種GPCRs別構(gòu)調(diào)節(jié)劑已被發(fā)現(xiàn)，并在疾病的治療上取得了一定的療效。例如，毒蕈堿型受體M1 和/或 M4的正性別構(gòu)調(diào)節(jié)劑、多巴胺受體D2的負(fù)性別構(gòu)調(diào)節(jié)劑（SB269652）治療精神性疾病等[9]。

研究報道，阿米洛利及其類似物（如Benzamil）對多種GPCR家族受體具有別構(gòu)調(diào)節(jié)作用[7,8]，因此，我們對其是否對α2C-AR具有別構(gòu)調(diào)節(jié)效應(yīng)進(jìn)行了檢測。首先，我們通過分子對接手段預(yù)測了此兩種化合物與α2C-AR的結(jié)合位點(diǎn)。 發(fā)現(xiàn)，阿米洛利與α2C-AR的潛在結(jié)合位點(diǎn)包括Glu377和Phe380，Benzamil與α2C-AR的潛在結(jié)合位點(diǎn)包括Asn160和Thr241。

與設(shè)想不一樣的是，這些位點(diǎn)與酚妥拉明和去甲腎上腺素的結(jié)合位點(diǎn)相近，提示，阿米洛利和Benzamil可能作用在α2C-AR的正性位點(diǎn)，而沒有作用在其別構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)。然而，作為分子對接的眾多軟件之一，CDOCKER有其自身的局限性，比如不能進(jìn)行柔性對接。因此，后續(xù)還需要采用其他的分子對接方法，比如flexible docking，或者分子動力學(xué)模擬，來進(jìn)一步探討阿米洛利和Benzamil與α2C-AR的作用模式。

配體受體解離動力學(xué)實(shí)驗(yàn)是檢測化合物是否是別構(gòu)調(diào)節(jié)劑的一種有效方法。我們的解離動力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿米洛利和Benzamil對3H-RX821002從α2C-AR上的解離速度沒有影響，表明阿米洛利和Benzamil對3H-RX821002不存在別構(gòu)調(diào)節(jié)作用。但是，別構(gòu)調(diào)節(jié)劑具有配體依賴性，因此，將來，我們還需檢測阿米洛利和Benzamil對其他配體的別構(gòu)調(diào)節(jié)作用。