以TWIST1為靶點的乳腺癌治療方法研究進展

耿直 袁東智

（四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院生理學教研室，四川 成都 610041）

Twist相關蛋白1（Twist-related protein 1，TWIST1）是一種堿性螺旋-轉角-螺旋（Basic helix-loop-helix，bHLH）轉錄因子。TWIST1參與上皮型腫瘤的進展已經(jīng)成為共識。近年，TWIST1在乳腺癌的進展中所起的作用得到越來越多的關注。TWIST1能夠募集核小體重塑去乙酰化酶(Nucleosome remodeling deacetylase，NuRD)對目標基因結合的組蛋白進行修飾[1]，參與細胞的表觀遺傳過程。由于TWIST1與上皮間充質(zhì)轉化還有雌激素受體（Estrogen receptor，ERα）表達的相關性，TWIST1被認為在乳腺癌的進展中起到重要作用。

上皮-間充質(zhì)轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）所指的是細胞從上皮表型轉變到間充質(zhì)表型的過程中的一系列多種類型、動態(tài)的移行狀態(tài)。EMT參與胚胎發(fā)育和癌進展中細胞形態(tài)的可塑性[2]。在EMT進展的過程中，本來相互之間聯(lián)系緊密的腫瘤細胞之間的連接逐漸變得松散，細胞失去極性，并且形態(tài)從不規(guī)則的上皮樣逐漸變成間充質(zhì)細胞特征性的紡錘樣。一系列與EMT相關的轉錄因子（例如鋅指E-盒結合同源異形盒1（Zinc finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1），TWIST1，鋅指蛋白SNAI（Zinc finger protein SNAI2，SNAI）2，鋅指蛋白SNAI1在EMT的進展過程中起到作用。TWIST1作為EMT及腫瘤轉移中的關鍵分子的地位已經(jīng)被廣泛承認，有報道稱上調(diào)永生化人乳腺上皮細胞（Immortalized human mammary epithelial cells，HMECs）的TWIST1表達能夠使HMECs出現(xiàn)EMT[3]。

TWIST1是一種bHLH轉錄因子，它可以與脫氧核糖核酸（DNA）結合并和其他蛋白產(chǎn)生相互作用。有關TWIST1的研究在近十年逐漸增多，它在腫瘤轉移中所起的作用逐漸被認識。TWIST1基因被上游信號（蛋白激酶Bα（Protein kinase Balpha， PKBα/AKT1）、 Wingless-Int蛋 白（Wingless-Int protein，Wnt）、轉化生長因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）等）激活后，其大量表達會使下游基因的表達產(chǎn)物數(shù)量發(fā)生變化，例如，導致E-鈣粘素表達下降和N-鈣粘素表達上升[4]。在上皮組織中，表達高E-鈣粘素的細胞通常具有更好的細胞間連接能力。N-鈣粘素主要在間充質(zhì)型細胞表達，其粘合力比E-鈣粘素要弱一些[2]。E-鈣粘素和N-鈣粘素這一對分子在腫瘤轉移過程中起到了關鍵作用，被認為是腫瘤轉移的標志分子。E-鈣粘素的減少和N-鈣粘素的增加通常被認為是EMT的重要標志。

近年，TWIST1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用受到廣泛關注，多項研究發(fā)現(xiàn)TWIST1能夠顯著降低ERα+乳腺癌細胞中的ERα的表達[5]。TWIST1通過抑制轉錄因子叉頭盒蛋白A1（Forkhead box protein A1，F(xiàn)OXA1）的表達進而抑制ERα的表達，過表達TWIST1后，乳腺癌細胞不僅發(fā)生了E-鈣粘素和N-鈣粘素的表達變化，其細胞形態(tài)也呈現(xiàn)基底型乳腺癌特征[6]。

另外，在他莫昔芬耐藥的乳腺癌中，發(fā)現(xiàn)TWIST1基因的表達上調(diào)[7]。這些研究提示，TWIST1在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到了不可忽視的作用。因此，TWIST1已成為乳腺癌靶向治療的一個熱門靶點，目前主要有三種策略:直接以TWIST1為靶點，通過影響TWIST1上游分子下調(diào)TWIST1，以及通過其它途徑影響TWIST1功能。現(xiàn)在對近10年該領域內(nèi)的研究成果做一總結，使用搜索引擎為Web Of Science，檢索式為(“ TWIST1”AND “breast cancer” AND“therapy”)，共得結果250條，經(jīng)篩選后對符合納入條件的文獻的內(nèi)容進行總結，并將相關研究的結果列于下文中。

1 直接以TWIST1為靶點的靶向藥物

微小RNA（microRNA，miRNA）可以通過與目標基因的信使RNA(Messenger RNA，mRNA)結合，抑制其蛋白翻譯，從而降低目標基因的表達，而miRNA藥物研發(fā)是近年的新興領域，目前已有多種該類藥物正在進行臨床試驗。以TWIST1為靶點的miRNA的研究也十分火熱。目前已發(fā)現(xiàn)幾類miRNA能夠抑制TWIST1的表達。miR-34a能夠通過同時識別ZEB1、神經(jīng)源性基因座notch同源蛋白1(Neurogenic locus notch homolog protein 1，NOTCH1)、TWIST1的mRNA，下調(diào)這三個基因的表達，從而抑制乳腺癌細胞的EMT過程。miR-300也可以直接識別TWIST1的mRNA，在乳腺癌細胞系MDA-MB-431中過表達miR-300能夠抑制其EMT的誘導發(fā)生[8]。

小分子干擾核糖核酸（Small interfering RNA，siRNA）可以識別并降解目標基因的mRNA，從而達到基因沉默的效果。但是，siRNA片段在體內(nèi)穩(wěn)定性較差，半衰期很短，已有研究發(fā)現(xiàn)，將納米微粒與siRNA結合，可以有效增加其穩(wěn)定性，該技術也運用到乳腺癌的靶向治療中[9]。目前多項研究顯示，以介孔二氧化硅納米粒子[10]和改性聚酰氨基胺聚合物[11]制備的納米顆粒，與靶向TWIST1的siRNA結合后作用于乳腺癌細胞，能夠有效降低TWIST1的表達水平。

除RNA外，百里醌也被發(fā)現(xiàn)具有針對TWIST1的作用。百里醌（Thymoquinone）是一種在植物小茴香中發(fā)現(xiàn)的化合物，目前發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤作用。在乳腺癌細胞中，百里醌與miR-34a聯(lián)合使用，可以增強miR-34a對NOTCH1與TWIST1的表達抑制作用。百里醌能夠增加乳腺癌細胞系BT-549中TWIST1啟動子的DNA甲基化，從而抑制TWIST1的基因表達，能夠抑制細胞的侵襲和遷移，且對小鼠異種移植瘤的生長和轉移有抑制效果[12]。

2 作用于TWIST1上游信號通路的藥物

TWIST1作為EMT信號通路中的關鍵分子，受到其上游通路的調(diào)控。一些藥物并不以TWIST1為直接靶點，但是可以影響其上游信號通路，從而影響TWIST1的表達或功能。

姜黃素（Curcumin）是一種天然酚類化合物，常用作食用色素。姜黃素對核因子-κB(Nuclear factor-kappaB, NF-κB)有抑制作用[13]，而NF-κB是TWIST1的上游激活分子[14,15]。實驗證明姜黃素在數(shù)個三陽性和三陰性乳腺癌細胞系模型中能夠抑制TWIST1的表達[16]。

Cyr61-結締組織生長因子-腎母細胞瘤-過度表達 5(Cysteine-rich61-Connective Tissue Growth Factor-nephroblastoma-overexpressed5, CCN5)是CCN蛋白家族成員，為富含半胱氨酸的分泌蛋白。缺氧誘導因子1（Hypoxia-induced factor-1, HIF-1）是TWIST1的上游激活分子[17,18]。在乳腺癌細胞中，CCN5能夠通過阻礙JNK信號通路對HIF-1α進行轉錄抑制，抑制TWIST1表達[19]。

L-正亮氨酸(L-norleucine)是亮氨酸的異構體，能夠影響骨骼肌中蛋白質(zhì)的合成。在HGC-27細胞（人胃癌細胞）中，L-norleucine能夠通過與核內(nèi)不均一核糖核蛋白A2/B1（Heterogeneousnuclear ribonucleoprotein A2/B1，hnRNPA2/B1）蛋白相互作用抑制其下游基因twist1和snail1的表達。實驗表明使用L-norleucine能夠抑制小鼠乳腺癌模型的肺轉移[20]。

樟芝（Antrodiacamphorata，AC）是一種藥用真菌，天然狀態(tài)下生長在牛樟樹的樹干中。Wnt/β-catenin信號通路中的Wnt1是TWIST1的上游激活分子[21]。在人三陰乳腺癌細胞中，使用AC的發(fā)酵液能夠抑制TWIST1表達，AC的發(fā)酵液能夠通過一個依賴糖原合酶激酶3(Glycogen synthase kinase 3，GSK3)的信號通路減少觀察到的Wnt/β-catenin核轉位[22]。

QLT0267是整合素連接激酶（Integrin linked kinase, ILK）的小分子抑制物。在乳腺癌細胞系中的實驗顯示，ILK過表達能夠引起TWIST1表達上升；使用ILK小分子抑制物QLT0267能夠抑制TWIST1的表達[23]。

白藜蘆醇（Resveratrol）是一種自然的抗氧化劑，具有減輕血液粘滯度，抑制血小板聚集和舒張血管，保持血液流動防止癌癥發(fā)生發(fā)展的作用。AKT1對TWIST1的磷酸化是β轉導重復相容蛋白(Beta-transducin repeats-containing proteins,β-TrCP)對TWIST1進行泛素化調(diào)節(jié)并促進其降解所必需的。在乳腺癌細胞中使用MK-2206，一種AKT1的抑制劑，能夠穩(wěn)定TWIST1并增強乳腺癌細胞的EMT。但是白藜蘆醇可以使MK-2206導致的乳腺癌細胞EMT減弱，它可以導致β-TrCP調(diào)節(jié)的TWIST1降解[24]。

四乙烯五胺(Tetraethylenepentamine, TEPA)，一種銅螯合劑。對CoCl2誘導的MCF-7細胞的EMT進行研究，對這種細胞使用TEPA可以起到抑制氯化鈷所導致的細胞形態(tài)變化的作用，并使細胞骨架重組。研究還發(fā)現(xiàn)TEPA的應用抑制了這種細胞中的HIF-1發(fā)揮轉錄調(diào)控作用，同時也下調(diào)了TWIST1和SNAI1的表達[25]。

紫檀芪（Pterostilbene），別名3, 5-二甲氧基-4'-羥基二苯乙烯，是來自紫檀等植物中的一種天然化學物質(zhì)。乳腺癌中存在腫瘤相關巨噬細胞（Tumor-associated macrophage, TAM）的情況下，使用紫檀芪發(fā)現(xiàn)miR-448的水平升高，同時伴隨著NF-κB和TWIST1水平的下降，實驗發(fā)現(xiàn)microRNA-448上調(diào)對NF-κB的表達有抑制作用[26]。

SK228是一種吲哚化合物。在乳腺癌細胞中，SK228能夠通過上調(diào)miR-200，尤其是miR-200c，來抑制TWIST1、鋅指E-盒結合同源異形盒2(Zinc finger E-box-binding homeobox 2, ZEB2)和SNAI2的表達[27]。

有研究表明TGF-β能夠增加乳腺癌細胞中TWIST1水平[28]。對使用TGF-β1后的三陰性乳腺癌細胞模型使用莪術和三棱藥物血清（Curcumae Rhizoma-Sparganii Rhizoma medicated serum）后，發(fā)現(xiàn)細胞的母親信號蛋白同源物3(Mothers against decapentaplegic homolog 3，Smad3)的磷酸化被抑制，而Smad3是TGF-β信號通路的重要信息傳遞分子，同時還觀察到細胞的TWIST1等蛋白表達被抑制[29]。

3 影響TWIST1功能的藥物

目前發(fā)現(xiàn)大量藥物能夠對乳腺癌細胞中TWIST1的活性或表達水平產(chǎn)生影響，但是其作用機制并不清楚。1400W、 L-NMMA和L-NAME是一氧化氮合酶的抑制劑，1400W抑制誘導型一氧化氮合酶，L-NMMA和L-NAME抑制多種類型的一氧化氮合酶。它們抑制三陰性乳腺癌小鼠模型中TWIST1等EMT相關轉錄因子的表達[30,31]。

多西環(huán)素（Doxycycline）能夠用于細胞實驗中使細胞的膜鐵轉運蛋白（Ferroportin，F(xiàn)PN)過表達。實驗中發(fā)現(xiàn)使用多西環(huán)素過表達FPN可以抑制4T1乳腺癌細胞株中TWIST1、SNAI1等EMT標志分子的表達[32]。

馬西替坦（Macitentan）是內(nèi)皮素受體A、B拮抗劑。在乳腺癌細胞MDA-MB-231的腦轉移小鼠模型中，macitentan可以抑制TWIST1的功能[33]。

葡萄籽原花青素（Grapeseedproanthocyanidins，GSPs）是從葡萄籽中提取得到的一種低聚原花青素的混合物。在實驗中發(fā)現(xiàn)，對HCC1937細胞使用GSPs可以降低TWIST1的表達[34]。

他莫昔芬（Tamoxifen）對兩種小鼠乳腺癌細胞使用后，能夠促進TWIST1的泛素化降解[35]。

褪黑素（Melatonin），是由松果體產(chǎn)生的一種胺類激素。對雌激素受體陽性的乳腺癌細胞MCF-7使用褪黑素，發(fā)現(xiàn)細胞中的TWIST1表達被抑制，同時發(fā)現(xiàn)褪黑素還影響一些可能靶向TWIST1的miRNA水平，例如miR-10a, miR-10b和miR-34a，推測褪黑素可以通過miRNA從轉錄后水平調(diào)節(jié)TWIST1的表達[36]。

石榴提取物（Pomegranateextract）是一種天然抗氧化劑，實驗發(fā)現(xiàn)它能夠抑制乳腺癌細胞系形成腫瘤干細胞，抑制腫瘤干細胞的自我更新，也發(fā)現(xiàn)其能夠下調(diào)TWIST1的表達[37]。

杓唇石斛素（Moscatilin）是杓唇石斛的一種成分。在乳腺癌細胞系的實驗中發(fā)現(xiàn)杓唇石斛素能夠抑制TWIST1基因的mRNA和蛋白的表達和AKT的磷酸化，但是杓唇石斛素抑制TWIST1的表達并非通過抑制AKT活性[38]。

Piperlongumine是從蓽茇中分離得到的化合物，它的抗菌、抗血管生成和抗糖尿病作用曾被研究。實驗發(fā)現(xiàn)TGF-β能誘導MCF-7細胞的TWIST1和SNAI1的表達升高，Piperlongumine的使用能夠抑制這種升高，并且劑量增加后還能將它們的表達水平抑制到低于對照組[39]。

槲皮素(Quercetin)是一種天然黃酮類化合物，可激活或抑制許多蛋白質(zhì)的活性。對雌激素受體陽性的MCF-7細胞使用槲皮素，發(fā)現(xiàn)槲皮素抑制了其TWIST1、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)等蛋白的表達，但是對雌激素受體陰性的MDA-MB-231細胞使用槲皮素沒有觀察到類似的效果[40]。

NVP-BEZ235和咖啡酸苯基酯(Caffeicacidphenylester, CAPE）分別是磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/ AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR)抑制劑和NF-κB抑制劑[41]。在對MCF-7細胞使用TGF-β處理兩周后，再將上述兩種藥物合用，發(fā)現(xiàn)MCF-7細胞中TWIST1的mRNA水平下調(diào)[42]。

二甲雙胍（Metformin）是常用糖尿病治療藥物。有實驗發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠降低乳腺癌干細胞的TWIST1、ZEB1、SNAI2和TGF-βs的表達[43]。

4 結語

近年研究已經(jīng)證實，TWIST1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展，特別是促進腫瘤轉移的EMT機制中發(fā)生重要作用。以TWIST1為靶點的藥物研究也越來越多。雖然目前，這些研究還處于臨床前階段，但是我們認為以TWIST1為靶點的藥物可能是未來乳腺癌治療的一個重要方向，推測其可以通過與其它藥物聯(lián)用，如他莫昔芬等內(nèi)分泌治療藥物，以及曲妥珠/帕妥珠單抗等分子靶向藥物，顯著提高治療效果，改善患者的預后。