脂肪干細胞局部注射改善淋巴水腫的實驗研究

周晨笑 蘇萬春 李 娜 梁順濤 張國英 馬 剛 李沛霖 崔 磊,*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院整形外科,北京 100089；2.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院淋巴外科,北京 100089；3.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院中心實驗室，北京 100089)

淋巴水腫是由于淋巴系統(tǒng)發(fā)育不良或繼發(fā)性損害引起淋巴液回流障礙，導致身體局部淋巴液滯留，進而繼發(fā)脂肪增生、組織纖維化等一系列的病理生理改變[1]。淋巴水腫的慢性疾病進程嚴重影響患者的生活和工作，深入了解淋巴水腫的發(fā)病機制、探索更有效的治療方法意義深遠。

炎性反應在淋巴水腫病理生理學中起著不可或缺的作用。研究[2-5]證實，淋巴水腫增生的脂肪組織中有各種炎性反應細胞浸潤，例如CD4+T淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞、Treg等。其中，CD4+T細胞在局部病灶的持續(xù)積累抑制淋巴管生成，并促進收集淋巴管的硬化，導致水腫和組織纖維化[6]。此外，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)[7]、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)[8]等多種炎性反應因子參與了淋巴水腫的疾病發(fā)生、進展。

最近，脂肪干細胞(adipose derived stem cells,ADSCs)在免疫相關疾病的研究中獲得很多關注。ADSCs是脂肪組織來源的間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)，具有來源廣、成本低等優(yōu)勢[9-12]。ADSCs在體外實驗及多種疾病模型中表現(xiàn)出免疫抑制作用[13]。研究[14]顯示，淋巴水腫組織中ADSCs含量減少，ADSCs是否作為有利因素在淋巴水腫組織微環(huán)境中耗竭還未可知。本研究主要討論淋巴水腫組織中局部補充ADSCs后，是否可以緩解淋巴水腫。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

本試驗所用實驗動物為C57BL/6J小鼠，雌性，6～8周齡(中國維通利華公司)，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2017-0025，本實驗通過首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院科學研究倫理委員會審批(2019年科研倫審第18號)，所有操作按照規(guī)范實施。本次實驗普通C57小鼠共50只，其中ADSCs組20只，PBS對照組30只。

1.2 ADSCs的提取、體外培養(yǎng)傳代、誘導

取C57乳鼠腹股溝及頸項部皮下脂肪，參照文獻[15-16]的方法提取ADSCs。首先將脂肪剪碎；加1 g/L的Ⅰ型膠原酶(美國Worthington公司)，置于搖床中，37 ℃，150 r/min，消化60 min；2 000 r/min 離心10 min；沉淀用配好的培養(yǎng)基重懸，接種于細胞培養(yǎng)皿，37 ℃，5%(體積分數(shù))CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為低糖DMEM(美國HyClone公司)，加入10%(體積分數(shù))胎牛血清(foetal bovine serum，F(xiàn)BS，中國中生奧邦生物科技有限公司)，1%(體積分數(shù))青霉素-鏈霉素混合溶液。細胞每48～72 h換液；貼壁細胞密度約90%時傳代，第3代至第5代(P3～P5)用于本研究的所有體內外實驗。

細胞密度>90% 時進行成脂誘導，成脂誘導液：低糖DMEM加入10%(體積分數(shù))FBS、1%(體積分數(shù))青霉素-鏈霉素混合溶液、200 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L 胰島素、1 μmol/L地塞米松。誘導第14天行油紅染色。

細胞密度約60% 時進行成骨誘導，成骨誘導液：低糖DMEM加入10%(體積分數(shù))FBS、1%(體積分數(shù))青霉素-鏈霉素混合溶液、0.1 μmol/L維生素D3、50 mmol/L維生素C磷酸酯、10 mmol/L β-甘油磷酸鹽。誘導第21天行茜素紅染色。

1.3 鼠尾淋巴水腫模型手術

應用10%(體積分數(shù))水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠。顯微鏡下距離鼠尾根部2.0～2.2 cm位置處做0.2 cm寬的全層皮膚環(huán)切，以離斷皮膚中的淺部毛細淋巴管。鼠尾兩側的兩條側靜脈各有兩條深部淋巴管伴行，結扎后離斷。透明貼膜環(huán)形包扎手術切口，保持切口部位濕潤。24 h 后拆除敷料，75%(體積分數(shù))乙醇消毒手術切口附近皮膚。手術前或術后即刻用排水法測量手術切口處至尾尖的體積，之后每周測量1次。

1.4 細胞注射

P3～P5代ADSCs消化處理為懸浮細胞，5×105個細胞溶于15 μL PBS中；造模術后，即刻將15 μL ADSCs懸液或磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)對照，用胰島素注射器(針頭規(guī)格：30G)距手術切口部位遠端1.5 cm處與鼠尾方向平行進針，針尖到達距手術切口部位遠端0.5 cm處注射，注射點在背靜脈與側靜脈之間的間隙部位小心進針，防止刺入血管。

1.5 鼠尾組織取材、染色

小鼠麻醉后，刮除鼠尾毛發(fā)(便于后期與包埋劑融合)，距離手術切口0.5～0.8 cm的部分小心取材，置于4%(質量分數(shù))多聚甲醛中固定24～48 h。鼠尾固定后切成0.2～0.3 cm厚的小段，需要包埋切片的組織置于10%(質量分數(shù)) EDTA中脫鈣，37 ℃，7～10 d，脫水、包埋、切片。之后行HE染色(蘇木精和伊紅染色)、Masson染色(馬松染色)。

鼠尾固定后切成0.2～0.3 cm厚的小段；PBS洗滌3遍，每次3～5 min；置于BODIPY (美國Molecular Probes公司)+Hochest 33258 (中國碧云天公司)工作液中浸染，室溫下15～20 min；PBS洗滌3遍，每次3～5 min；共聚焦熒光顯微鏡(日本尼康公司A1)下觀察、拍攝。

切片于1× 檸檬酸鹽(0.01 mol/L)中抗原修復，山羊血清封閉，一抗4 ℃ 孵育過夜；室溫復溫1 h；滴加與一抗對應的二抗，室溫孵育1 h；PBS緩沖液洗后用含DAPI的封片劑封片；閱片，4 ℃避光保存。應用正置熒光顯微鏡(日本尼康公司ECLIPSE TS200)閱片、拍攝。

本試驗所用到的一抗：淋巴管內皮透明質酸受體1抗體 (anti-lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1，LYVE-1)(1∶500,英國Abcam公司),二抗：山羊抗兔Alexa Fluor 488熒光二抗 (英國Abcam公司)。

淋巴回流檢測(FITC-Dextran標記鼠尾淋巴回流):FITC-Dextran (2 000 000,25 g/L,美國Sigma公司)溶于PBS中配制成25 g/L的工作液，錫箔紙包裹避光，現(xiàn)用現(xiàn)配；腹腔注射10%(體積分數(shù))水合氯醛(4 mL/kg)，麻醉小鼠，在距離尾尖1.5 cm位置處皮下注射15 μL FITC-Dextran工作液；15 min后于宏觀熒光顯微鏡下拍照，保證工作環(huán)境黑暗，曝光時間調至70 ms。

1.6 統(tǒng)計學方法

本研究中數(shù)據應用GraphPad Prism 6.02進行統(tǒng)計分析以及作圖，兩組數(shù)據的比較采用Studentst檢驗，多組實驗組與對照組分別進行比較時采用Dunnett檢驗法，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ADSCs局部注射后鼠尾腫脹緩解

ADSCs貼壁生長，成梭形,成脂誘導后，油紅染色見細胞內紅染的油滴形成；成骨誘導后，茜素紅染色見紅染的鈣結節(jié)沉積(圖1)。兩種染色說明了ADSCs正常的兩系分化能力。對提取的ADSCs進行初步鑒定后，在手術當日將ADSCs注射于鼠尾皮下。注射ADSCs后1～4周，鼠尾體積較對照組減小，4周之后與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。HE染色可見皮下組織的厚度減小，組織Whole mount-BODIPY熒光染色可明確脂肪厚度亦明顯減輕，平均值降低約40%，效果明顯(圖2)。

圖1 C57小鼠脂肪干細胞體外培養(yǎng)及誘導Fig.1 In vitro culture and induction of ADSCs extracted from C57 subcutaneous adiposeA:ADSCs were cultured in vitro and that at passages 3 to 5 were used in the following studies,Bar=200 μm;B：Oil red O staining of ADSCs were performed after adipogenic differentiation for 14 days,Bar=50 μm;C：Alizarin red staining of ADSCs were performed after osteogenic induction on days 21,Bar=200 μm;ADSCs:adipose derived stem cells.

圖2 ADSCs局部注射后鼠尾體積減小，皮下組織及脂肪厚度減少 Fig.2 Change in edema and subcutaneous fat thickening in mouse tail lymphedema modelsA:representative photographs of tails;B：quantification of tail volume changes (n=11-30),*P<0.05;***P<0.001;C：representative HE staining of tail cross-sections with arrows indicating subcutaneous tissues 3 weeks after PBS or ADSCs injection,Bar=1 μm;D：quantification of subcutaneous tissue thickness,***P<0.001;E:Whole-mount staining of BODIPY to indicate subcutaneous adipose tissues 3 weeks after ADSCs injection,Bar=500 μm;F:quantification of subcutaneous adipose tissues,**P<0.01,***P<0.001.ADSCs:adipose derived stem cells.

2.2 ADSCs有效減輕鼠尾皮下組織纖維化

ADSCs干預組的皮下組織的纖維化較對照組有所緩解，Masson染色可見皮下組織中藍染的膠原纖維減少(圖3A)，應用Image J軟件分析，膠原纖維所占面積比下降約20%(圖3B)。

圖3 ADSCs局部注射后皮下組織纖維化減輕Fig.3 Subcutaneous injection of ADSCs reduces fibrotic tissue deposition A:Sirius red histological staining to evaluate fibrotic tissue deposition revealed a reduction of fibrosis 3 weeks after ADSCs injection (n=6 per group,6 HPF per mouse);B:percent of fibrotic area,**P<0.01;ADSCs:adipose derived stem cells.

2.3 ADSCs改善鼠尾淋巴管形態(tài)及淋巴回流

淋巴回流是評價淋巴水腫的重要功能指標，術后8周 FITC-Dextran標記后應用熒光顯微鏡檢測熒光，ADSCs組可見大分子熒光染料通過手術切口，而PBS對照組僅見少量通過。且ADSCs干預后，手術切口近心端與遠心端熒光比值較對照組升高，ADSCs干預后，淋巴回流有所改善。淋巴管的功能決定淋巴回流，免疫組織化學和免疫熒光染色均證實，ADSCs干預后，雖然每個高倍鏡下的淋巴管數(shù)量未發(fā)生變化，但是橫截面積減小約3倍，說明淋巴管功能改善(圖4)。

圖4 ADSCs局部注射后淋巴管形態(tài)及淋巴回流改善Fig.4 Subcutaneous injection of ADSCs improves lymphatic vessel functionA:Lymphatic reflux was detected by subcutaneous injection of FITC-dextran and photographed by fluorescence microscopy at 8 weeks postoperatively;B:Lymphatic transport capacity was improved after ADSCs treatment (n=6 per group),*P<0.05;C:Immunofluorescence staining for LYVE-1(green) showed lymphatic vessel 3 weeks after ADSCs transfer,Bar=100 μm;D:Area of lymphatic vessels were decreased in ADSCs transfer group,**P<0.01,***P<0.001;E:number of lymphatic vessels showed no statistical difference (n=6 per group,6 HPF per mouse),*P<0.05.ADSCs:adipose derived stem cells;LYVE-1:lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1;HPF：high power mirror.

3 討論

目前，ADSCs已被用于多種疾病的研究，干預方式主要分為靜脈注射及局部注射。考慮到局部作用方式更直接，且靜脈注射有肺靜脈栓塞的風險[17]，故本研究選擇局部皮下注射。

ADSCs干預后，鼠尾腫脹減輕，充分說明了ADSCs注射對于緩解淋巴水腫的有效性。但是，鼠尾的體積只在ADSCs注射后4周內差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，之后與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。推測出現(xiàn)這種情況的原因：首先，研究[18]顯示，ADSCs在沒有特殊載體情況下，以緩沖液為懸液直接局部注射，活體小動物成像檢測顯示其可在局部存活1周。所以考慮ADSCs注射1周后細胞量逐漸減少，無法維持更有效的作用。其次，鼠尾模型有自限性[4]，隨著時間的推移，二者差距逐漸減少。至此，為了得到更明顯的治療效果，考慮可以多次注射ADSCs。Conrad等[19]多次注射MSCs,結果差異有統(tǒng)計學意義。因為鼠尾模型的特殊性，在實施過程中，多次皮下注射明顯增加鼠尾出血、壞死、掉尾等情況的發(fā)生率，所以實驗未能成功進行。

淋巴水腫局部病灶中，皮下脂肪組織增厚是最為顯著的病理變化[14,20]。此外，纖維化也是重要的病理變化，研究[14]顯示，不僅組織皮下脂肪發(fā)生纖維化，淋巴管壁以及新生的毛細淋巴管均出現(xiàn)纖維化，纖維化嚴重影響淋巴管功能，加重淋巴水腫[20-21]。淋巴水腫中，淋巴回流受阻，導致淋巴液逆流，皮層內毛細淋巴管顯著擴張，功能受損。

淋巴水腫動物模型研究[4]顯示造模后2周，淋巴水腫病灶中出現(xiàn)大量新生的淋巴管，但是新生的淋巴管管腔不規(guī)則，腔內面積增大，Ogata等[22]認為，這種不成熟淋巴管的大量形成不利于淋巴水腫的預后。ADSCs干預后，鼠尾皮下組織及脂肪層厚度減少、纖維化減輕、淋巴管橫截面積減小、淋巴回流改善，充分說明了ADSCs注射對于緩解淋巴水腫的有效性。

多項研究[13,23-24]顯示，ADSCs具有低免疫原性，它通過抑制淋巴細胞反應、誘導M2型巨噬細胞、增強巨噬細胞的免疫抑制能力、誘導Treg等多種方式抑制免疫反應。炎性反應在淋巴水腫疾病進展中起著不可或缺的作用，因此筆者認為，ADSCs對淋巴水腫的緩解作用，可以通過緩解局部炎性反應而實現(xiàn)。

總之，ADSCs對淋巴水腫具有明確的緩解作用。作用機制也許存在多種，仍有待于進一步探索。同時，ADSCs對于臨床治療淋巴水腫疾病具有潛在的應用前景。