遠志皂苷對脂多糖誘導的帕金森病模型大鼠的作用及機制研究

袁惠莉 宮曉麗 范 征 梁志剛 王曉民,6*

(1.北京衛生職業學院思想政治教學部，北京 101101；2.首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，北京 100069；3.首都醫科大學教育部神經變性病重點實驗室，北京 100069；4.首都醫科大學基礎醫學院藥理學系，北京 100069；5.青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院神經內科，山東煙臺 264000；6.首都醫科大學北京腦重大疾病研究院，北京 100069)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是1817年英國醫生James Parkinson發現的多發于中老年人的中樞神經系統退行性疾病，主要病理改變是黑質致密區(substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺(dopamine,DA)能神經元變性、死亡，殘存神經元胞質內嗜酸性包涵體即路易小體(Lewy’s body,LB)形成，紋狀體中DA含量減少[1]。患者典型的臨床癥狀為震顫、肌僵直和運動遲緩等。隨著社會老齡化進程的加快，PD的發病率逐年上升，給患者、家庭和社會帶來沉重負擔，日益成為突出的社會問題。

PD的病因和發病機制至今仍未闡明，目前認為是多種因素綜合作用的結果。在PD患者及所有PD動物模型腦內均可見SNpc區DA能神經元丟失伴隨過度的小膠質細胞活化，并且這種病理變化發生在PD早期并持續整個病程，表明小膠質細胞功能異常與PD的發生和發展密切相關。小膠質細胞作為中樞神經系統重要的免疫細胞，在受到感染、毒物等因素刺激后會釋放大量促炎因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1,-6家族成員、IL-1、IL-6和前列腺素等，引發炎性反應。這些神經毒性物質與DA神經元表面的相應受體結合后，通過細胞內的信號轉導通路，最終導致神經元的變性壞死。提示抑制小膠質細胞的激活及其引發的炎性反應，很可能對PD的預防及治療起到積極作用。

遠志(radix polygalae)是遠志科植物遠志和卵葉遠志的干燥根，性溫，味苦、辛，《神農本草經》記載其具有安神、益智、祛痰、消腫的功能。遠志的活性成分有很多，包括皂苷類、黃酮類、寡糖酯類、生物堿等，其中遠志皂苷(Tenuigenin，TEN)是從遠志根中分離得到的五環三萜類化合物，是遠志的主要活性成分，具有抗癡呆、抗衰老、抗感染、抗氧化等藥理作用[2-8]。TEN可以促進淀粉樣前體蛋白的降解，改善阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)動物模型的認知和行為。無論是動物實驗還是細胞實驗均顯示[9-12]TEN可以通過抑制氧化應激和炎性反應，改善腦內單胺類神經遞質的含量，增加神經營養因子的釋放等途徑，發揮神經保護作用。本研究旨在通過建立細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的PD炎癥性大鼠模型，探討TEN是否通過其抗感染活性發揮了對DA能神經元的保護作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠50只，體質量240～260 g，由維通利華實驗動物技術有限公司提供,實驗動物許可證號:SYXK(京)2018-0003。每籠5只群養，籠底鋪以鋸末，12 h/12 h晝夜循環照明，自由飲水和飲食。實驗開始前適應環境一周。本實驗所有操作均符合《中華人民共和國動物保護法》，通過了首都醫科大學動物倫理委員會的批準。

1.2 主要藥品

TEN由北京師范大學認知神經科學與學習國家重點實驗室張占軍教授提供，系采用遠志科植物遠志(Polygala Tenuifolia Willd)干燥根提取物，化學結構詳見圖1，分子式為C30H45ClO6，平均相對分子質量為537 140。

圖1 遠志皂苷的分子結構式Fig.1 Chemical structure of Tenuigenin

1.3 PD模型制備及分組

單側黑質內注射脂多糖(lipopolysacharide,LPS)(美國Sigma公司)制備炎癥PD大鼠模型。向大鼠右側黑質內注射2μL(10 μg) LPS，建立炎癥性PD大鼠模型，同時設立黑質內注射2 μL磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)的對照組。腹腔注射350 mg/kg水合氯醛(北京中國醫藥公司)麻醉動物。實驗設立對照組、LPS模型組、TEN低濃度處理組(200 mg/kg)、TEN高濃度處理組(300 mg/kg)、阿司匹林(aspirin,ASP,32 mg/kg)處理組，每組10只大鼠。各組動物適應環境1周后，于手術前2周開始以灌胃形式給予0.9%(質量分數)氯化鈉注射液及不同濃度的藥物，1次/d，共14周。術后第7 周和第11周用轉棒實驗檢測大鼠的運動協調能力，第12周用曠場實驗檢測大鼠自主運動能力，并于24 h內處死動物。其中每組區組隨機法取4只，用4%(質量分數)多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)灌流固定，用于酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫組織化學染色，檢測黑質DA能神經元的存活率；其余動物先心臟取血，然后斷頭處死，取雙側黑質，用于ELISA法檢測血漿及黑質中TNF-α和IL-1β的濃度，同時取主要臟器進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色，觀察TEN對主要臟器的影響。詳見圖2。

圖2 實驗流程圖Fig.2 Experimental designPD:Parkinson’s disease;TEN:Tenuigenin;PBS:phosphate-buffered saline;LPS:lipopolysaccharide；TH：tyrosin hydroxylase;IL-1β:interleukin-1β;TNF-α:tumor necrosis factor-α;ASP:aspirin.

1.4 行為學測試

采用Accuscan 2.11 system大鼠自主活動監測系統記錄大鼠的自主活動。每箱一只，測試前適應環境10 min，設定測試時間為30 min，行為測試儀統一記錄，注意保持測試環境安靜。測試完畢后用配套軟件對運動次數、活動時間、休息時間、活動距離等運動指標進行計算、統計和分析。

轉棒行為測試，造模前2周對大鼠進行轉棒行為訓練，并測試大鼠的轉棒行為，每只測試3次，以在轉棒上停留時間最長一次為準記錄數據，以后在造模后第7周和第11周各進行一次轉棒測試，每只測試3次，以在轉棒上停留時間最長一次為準記錄數據。

1.5 ELISA法檢測黑質及血漿中TNF-α和IL-1β濃度

大鼠斷頭處死后，剝離腦，切取中腦，以中腦導水管的橫斷面為界，切除背側腦組織，分離雙側黑質，在液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱保存。將樣品置于2 mL Eppendorf管中，加入冷凍的組織裂解液200～300 μL，冰浴中超聲勻漿(0.5 Hz，即振動1 s，間歇1 s，反復4～5次)，4 ℃ 15 000 r/min離心15 min，取上清150 μL分裝于1.5 mL Eppendorf管，-80 ℃冰箱保存，用于測定細胞因子及蛋白定量。用1 mg/mL標準牛血清白蛋白溶液，校準蛋白質檢測儀。樣品測定時，先將樣品稀釋40～80倍，然后取50 μL比色測定。按照ELISA試劑盒(上海 ExCell Biology公司)說明書的操作步驟進行，測定黑質中TNF-α和IL-1β的濃度。

將新鮮的大鼠血液收集在無熱源、無內毒素的采血管中，采血管提前用抗凝劑乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)處理，1 000 g離心10 min，將上層黃色半透明液體移入新的1.5 mL Eppendorf管中，4 ℃保存待檢測。24 h內按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟進行，測定血漿中TNF-α和IL-1β的濃度。

1.6 TH免疫組織化學染色檢測黑質DA能神經元的存活率

每組取4只大鼠經心臟灌流取材。腹腔注射1 mL 17.5%(質量分數)的水合氯醛深麻醉，剖開胸腔暴露心臟。經左心主動脈灌流100 mL 37 ℃的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，隨后灌流200 mL冰冷的4%(質量分數) PFA。打開顱骨取出全腦并切取中腦部分，置于4%(質量分數) PFA 4 ℃固定12 h，并用20%和30%(質量分數)的蔗糖溶液梯度沉淀。自蔗糖溶液中取出組織塊，OCT包埋，然后投入-60 ℃的正己烷中驟冷35 s，用Leica冰凍切片機進行中腦切片，厚度為35 μm，共留取切片30張。切片貼在三乙氧基硅烷(3-aminopropyl-triethoxysilane,APES)處理過的載玻片上，冷風吹干，-20 ℃保存。其中第1、5、10、15、20和25張組織切片進行TH免疫組織化學染色。經TH免疫組織化學染色后，每只動物取2張切片，進行黑質致密部TH陽性細胞的計數，并計算每只動物左側和右側陽性細胞數的比值。此過程為雙盲進行。

1.7 大鼠主要臟器形態檢測

在PBS組、LPS組、LPS+TEN 200 mg/kg組和LPS+TEN 300 mg/kg組，隨機選取5只動物，斷頭處死后快速分離心臟、肝臟、脾臟、腎臟和肺臟，置甲醛固定后，石蠟包埋，切片后進行HE染色，光學顯微鏡觀察形態學改變。組織器官切片蘇木精-伊紅染色方法(HE染色)：配制蘇木素染液，無水乙醇100 mL、甘油100 mL、蘇木精2 g、鉀明礬2 g、醋酸5～10 mL，置于陽光下自然氧化3個月左右成熟。配制伊紅染液，伊紅 0.5 g溶解于100 mL的80%(體積分數)乙醇。按照HE染色步驟,依次取材組織塊，固定后石蠟包埋，做7 μm切片，用二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗，蘇木素染色5 min，自來水沖洗；鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min或溫水(約50 ℃)5 min，置伊紅染液2 min，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，普通光學顯微鏡下觀察結果，大恒圖像采集軟件拍照。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 TEN改善PD模型大鼠的行為

轉棒實驗中，用造模前轉棒持續時間，減去造模后轉棒持續時間，數值差距越少則代表損傷越小。圖3顯示，造模后11周時，TEN低劑量組、TEN高劑量組及ASP藥物組大鼠棒上停留時間差值較模型組明顯減少，分別達模型組的25%、35%和34%，且差異有統計學意義。

圖3 TEN對PD模型大鼠運動協調能力的影響Fig.3 Effects of TEN on the rotarod trial of PD ratsBefore operation-after operation latency time (s) at 7 weeks and 11 weeks.The results showed as n=6;**P<0.01,***P<0.001 vs LPS;###P<0.001 vs PBS.TEN:Tenuigenin;PD:Parkinson’s disease;PBS:phosphate-buffered saline;LPS:lipopolysaccharide;ASP:aspirin.

曠場實驗中，圖4可見，TEN及ASP均可改善PD模型大鼠的自主活動行為。模型組較其他組別，在運動的總距離、水平活動次數、運動時間及刻板計數方面都明顯縮短和減少，TEN低劑量組、高劑量組及ASP藥物組可以延長或增強PD模型大鼠的活動總距離、水平活動次數、活動時間及刻板計數情況，分別達模型組的321%、253%和279%，204%、165%和185%，243%、205%和205%，210%、167%和204%，同時休息時間較模型組縮短，下降至模型組的87%、90%和91%，差異有統計學意義。其他各組間差異無統計學意義。

圖4 TEN對PD模型大鼠曠場實驗的影響Fig.4 Effects of TEN on the locomotor activity of PD ratsA:total movement distance;B:horizontal activity;C:movement time;D:stereotypy counts;E:rest time;F:the track-plot pictures of rats in half-hour.The results showed as n=6；*P<0.05,**P<0.01 vs LPS;#P<0.05,##P<0.01 vs PBS;TEN:Tenuigenin;PD:Parkinson’s disease;PBS:phosphate-buffered saline;LPS:lipopolysaccharide;ASP:aspirin.

2.2 TEN降低PD模型大鼠黑質及血漿中TNF-α和IL-1β濃度

本實驗采用ELISA方法，檢測了黑質及血液中細胞因子TNF-α和IL-1β的濃度。結果顯示，經過黑質內注射10 μg LPS誘導后，模型組損傷側黑質內TNF-α的蛋白含量達3.904 pg/mg，IL-1β的蛋白含量達6.92 pg/mg(圖5)，分別比對照組增加了86%及458%。TEN低劑量組、高劑量組及ASP藥物組損傷側兩種細胞因子的濃度均低于模型組，其中TNF-α的濃度分別降低47%、38.3%和19.7%(圖5A)，同時IL-1β的生成也受到TEN的明顯抑制，濃度分別降低45.1%和82.1%，ASP組也有一定抑制作用，但與模型組比較，差異無統計學意義(圖5B)。各實驗組血液中兩種炎性反應因子也有差別，模型組血液中TNF-α的濃度為279.8 pg/mg，IL-1β的濃度為347.8 pg/mg(圖5C，D)，分別比對照組增加了41.5%和3.9%。TEN低劑量組、高劑量組及ASP藥物組TNF-α的濃度低于模型組，分別為模型組的39%、29.1%和42.7%，其中TEN低劑量組及ASP藥物組的差別有統計學意義(圖5C)，3個藥物組IL-1β的濃度略低于模型組，差異無統計學意義(圖5D)。以上結果顯示TEN有效地抑制了LPS誘導的小膠質細胞合成和釋放細胞因子，ASP也具有一定的抑制作用，但從實驗結果分析，效果較TEN差。

圖5 TEN對PD模型大鼠黒質及血漿中炎性反應因子含量的影響Fig.5 Effects of TEN treated on the concentrations of proinflammatory cytokines in the SNpc and plasma of PD ratsThe concentration of TNF-α and IL-1β LPS were detected using commercial ELISA kits.The results showed as n=4-6(A，B)，n=5(C,D);*P<0.05 vs LPS;#P<0.05,##P<0.01 vs PBS;TEN:Tenuigenin;PD:Parkinson’s disease;PBS:phosphate-buffered saline;LPS:lipopolysaccharide;ASP:aspirin;TNF-α:tumor necrosis factor-α;IL-1β:interleukin-1β;SNpc:substantia nigra pars compacta.

2.3 TEN增加PD模型大鼠黑質致密部DA能神經元的數目

TH是DA合成的限速酶，存在于DA能神經元的胞質內，通過TH免疫組織化學染色法，可以鑒定DA能神經元，并觀察DA能神經元形態和數量的改變。TH免疫組織化學染色的結果顯示，模型組黑質內注射LPS后，注射側(右側)黑質致密部的DA能神經元大量死亡(圖6A)，與非注射側(左側)相比殘存的神經元只有62%；TEN 300 mg/kg組黑質致密部的TH陽性細胞形態正常，結構完整，數目明顯多于模型組，存活率可達85%；TEN 200 mg/kg組及ASP 32mg/kg組黑質致密部的TH陽性細胞數目有上升趨勢，但和模型組相比差異無統計學意義(圖6B)。

圖6 TEN對PD模型大鼠黑質TH陽性神經元存活率的影響Fig.6 Effect of TEN of the survival faction of TH-positive neurons in substantia nigra pars compacta of PD rastsA:HE staining;B:statistic data.Photomicrographs were captured using a SPOT-2 imaging analysis system.The scale bar represents 500 μm.The results showed as n=4;*P<0.05 vs LPS;##P<0.01 vs PBS;TEN:Tenuigenin;PD:Parkinson’s disease;TH：tyrosine hydroxylase;PBS:phosphate-buffered saline;LPS:lipopolysaccharide;ASP:aspirin.

2.4 TEN對PD模型大鼠主要臟器組織形態學無可見改變

以TEN灌胃方式治療PD模型大鼠，對其心臟、肝臟、脾臟、腎臟和肺臟器官的組織形態學無明顯影響(圖7)。

圖7 TEN對主要代謝器官的組織形態學無明顯影響Fig.7 TEN has no visible morphology changes in the main organs of ratsAt 12 weeks,rats were decapitated,and the main organs were quickly separated,fixed with formaldehyde,embedded in paraffin,HE stained after sectioning,and no obvious morphological changes were observed under light microscope.The scale bar represents 200 μm.n=5;TEN:Tenuigenin;PBS:phosphate-buffered saline;LPS:lipopolysaccharide.

3 討論

由于PD的病因和發病機制至今不明，因此臨床尚無有效的治療手段，目前以藥物治療為主，采用的是以DA前體物質——左旋多巴(levodopa,L-Dopa)為主的藥物替代療法，但該法只能改善癥狀，不能控制PD進程，長期應用會出現嚴重的不良反應——“開-關”現象。本實驗室大量研究[13-18]表明，雷公藤內酯醇(T10)、海帶褐藻多糖硫酸酯、遠志皂苷等中藥單體及有效成分均具有神經保護作用，對PD模型動物的DA能神經系統有較好的保護和治療作用，具體作用途徑與抗感染、抗氧化機制密切相關。中藥治療以其毒副作用小，協同作用強和整體調節的優勢，為PD藥物防治研究提供了良好前景。研究[19-21]表明，在PD疾病進程中DA能神經元的損傷與小膠質細胞炎性反應密切相關，因此本研究中選取常用于激活小膠質細胞的工具藥物——LPS構建炎癥性PD大鼠模型。大鼠腦黑質部位定點注射LPS可誘導小膠質細胞的激活，并伴有該部位神經元丟失，模擬了PD患者腦部病變特點。一定劑量的LPS注射可造成明顯的動物旋轉行為異常，引起CD11b陽性的小膠質細胞數量增多，呈明顯激活狀態，繼而導致黑質致密部DA能神經元的退變、數量減少，紋狀體DA及其代謝物含量降低，且該模型隨時間延長對DA能神經元的損傷進行性加重，類似于人類PD患者病情緩慢進行性加重的特點。此模型用于研究炎性反應在PD發病過程中的作用，適用于通過干預炎性反應，發揮對DA能神經元的保護作用。同時，為模擬臨床中藥治療方式，以灌胃的方式給藥，給藥周期達到一個藥物療程(約為3個月)，觀察藥物對多巴胺能神經元的保護作用。資料[10]表明，換算成大鼠灌胃劑量為150～300 mg/kg，結合資料及前期實驗結果，TEN大鼠灌胃的有效劑量在200～300 mg/kg之間，為此，選取了200 mg/kg和300 mg/kg兩個藥物劑量組進行實驗。此外，有文獻[22]顯示，TEN具有一定的溶血毒性，堿水解后毒性顯著降低，但仍需進一步的藥物安全性檢測。實驗中，兩個TEN劑量組，長期以灌胃形式給藥，未發現實驗動物有不良反應，且通過臟器切面HE染色觀察，對主要代謝器官心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的組織形態學沒有明顯影響，顯示TEN適當劑量口服給藥，具有較好的安全性。

無論是體內還是體外實驗，TEN均顯示出較強的抗感染活性。例如，TEN可以治療LPS所致的小鼠急性肺損傷，可以抑制LPS所致的巨噬細胞RAW 264.7的激活，減輕LPS/GalN誘導的小鼠急性肝損傷[23]。TEN同時具有神經保護作用，不僅可以通過抑制超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶及減少tau蛋白的過度磷酸化，發揮對神經元的保護作用[24-25]，而且可以通過抗Aβ聚集、抗感染、抗氧化、抗神經元細胞凋亡，增強中樞膽堿能系統，促進神經元增生，發揮對AD相關的多重神經保護功能，改善AD模型鼠的認知行為[26-27]。本課題組既往的研究[11-12]顯示，TEN不僅可以通過清除一氧化氮(nitric oxide,NO)自由基，抑制小膠質細胞活化釋放基質金屬蛋白酶-9、TNF-α和IL-1β，發揮對神經元的保護作用，還可以通過減少活性氧自由基產生，抑制小膠質細胞中核苷酸結合寡聚化結構域受體家族3炎癥小體激活，減輕炎性反應對神經元的損傷。本研究顯示，TEN能抑制LPS所致的炎癥性PD模型大鼠的外周血漿和腦內黑質炎性反應因子的濃度，減少DA神經元的丟失，減輕PD模型大鼠的行為學損傷，證明這種神經保護作用與其抑制小膠質細胞炎性反應密切相關。

阿司匹林作為一種臨床常用的非甾體類抗炎藥，具有解熱、鎮痛、抗感染等功效，其抗感染機制與抑制前列腺素(prostaglandin,PG)合成酶，減少PG類致炎物質的合成有關，因此本研究選取ASP作為陽性對照藥。TEN在細胞水平可以通過抑制PGE2及NO發揮抗感染作用[28-30]，本研究顯示，高劑量TEN組抑制黑質炎性反應因子的效果明顯優于ASP組，保護黑質DA神經元的作用也優于ASP處理組，說明TEN可以通過多種途徑發揮抗感染作用，其神經保護作用優于ASP。研究同時顯示，TEN對外周血漿中炎性反應因子的抑制效果不如對腦內黑質中炎性反應因子的抑制效果，推測可能與TEN水解成分藥代動力學有關。文獻顯示[22,31]，遠志皂苷水解產物多樣，主要成分為3,4,5-三甲氧基肉桂酸(3,4,5-Trimethoxy-cinnamylic acid,TMCA)、對甲氧基肉桂酸(p-Hydroxy methyl cinnamate,PMCA)和細葉遠志皂苷(Tenuifolin,TF)。動物實驗經口服給藥后，TMCA和PMCA能快速達到較高的血藥濃度峰值(6.33 μg/mL和4.54 μg/mL)，發揮作用后被很快消除，體內滯留時間短，且不能通過血腦脊液屏障；而TF達到血藥濃度的峰值時間長，雖然峰值低(0.37 μg/mL)，但可以通過大鼠血腦脊液屏障到達腦組織(藥物峰值可達到0.25 μg/mL)，且滯留時間長，有利于其發揮生物學活性。因此，筆者推測TEN在腦內很可能是通過TF發揮抑炎作用。本研究證明了TEN可以通過抑制炎性反應因子TNF-α和IL-1β的釋放，保護DA神經元，但其抗感染作用的分子機制尚未闡明，亟待進一步深入研究。

綜上所述，本研究顯示TEN能夠改善炎癥性PD模型大鼠的行為學損傷，減輕黑質DA能神經元的丟失，抑制LPS誘導的黑質小膠質細胞分泌促炎因子。TEN作為傳統中藥遠志的提取物，具有較好的安全性，開發其作為PD防治藥物有很好的臨床應用前景。