Satb2基因慢病毒載體的構建及其鑒定

陳曉霞，顏世果，李玉蘭

1.陜西省康復醫院口腔科，陜西 西安 710065；2.山東大學口腔醫學院牙周科 山東省口腔生物醫學重點實驗室，山東 濟南 250012

牙周病是危害人類健康的三大疾病之一。目前牙周病雖然可以通過系統的牙周治療取得良好的炎癥控制和功能改善[1-3]，但牙槽骨一旦發生吸收就很難重建，這也是很多牙周炎患者最終拔牙的主要原因。為尋找一種因子在基因水平上調控牙槽骨組織的再生，從而使缺失的牙周支持組織得以重建已成為研究者們努力奮斗的方向。

特殊富含AT 序列結合白2 (special AT-rich sequence binding protein2，Satb2)是近十年來研究的熱點基因，它是一種核基質蛋白，同時也是具有高活性的轉錄因子。已有研究發現在牙周創傷的小鼠模型中植入Satb2 過表達的牙囊細胞和骨髓基質細胞，經組織學檢查均可觀察到小鼠牙周缺損區骨質的再生和創傷愈合能力的增強，說明Satb2 蛋白在牙周創傷愈合的過程中起到了一定的促進作用[4]。但國內外對Satb2基因在牙周組織再生中的作用研究還是非常少，仍需要進一步探討。本實驗通過構建Satb2慢病毒表達載體，為進一步研究該基因在牙周組織再生中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 pBS-SK-Satb2、293T細胞(山東省口腔生物醫學重點實驗室提供)；pLenti6.3-IRES2-EGFP/V5 DEST 及包裝質粒Mix (美國Invitrogen)；E. coli DH5a感受態細菌(全式金公司)；Marker DL5000、Marker 15000、質粒大量提取純化試劑盒、多功能凝膠回收試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)；限制性內切酶PacⅠ和AscⅠ、T4DNA Ligase (Fermentas 公司)；POLOdelivererTM3000轉染試劑(上海銳賽生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Satb2 基因引物設計與合成 參照Gen-Bank中目的基因Satb2 (NM-139146)序列設計PCR引物，同時在Satb2基因的上下游分別添加酶切位點PacⅠ和AscⅠ，上游引物為：5'-CTGTCATTAATTAAGCCAC CATGGAGCGGCGGAGCG-3'，下游引 物為：5'-TCTACGGCGCGCCTTATCTCTGGTCGGTTTCGGC-3'，引物序列中添加的酶切位點PacⅠ和AscⅠ分別用紅色字體標出。

1.2.2 目的基因的擴增 以攜帶目的基因的質粒pBS-SK-Satb2 為模板擴增目的基因Satb2，參照說明書配制PCR反應體系，該循環體系如表1所示，循環結束后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，并用凝膠回收試劑盒回收所需的目的片段。

1.2.3 重組慢病毒載體連接構建 Satb2 基因PCR產物和慢病毒載體分別用PacⅠ和AscⅠ進行雙酶切，凝膠電泳分離酶切片段，回收目的片段。酶切后的PCR產物及目的載體通過T4DNA ligase 連接，配置連接體系如下：10×T4連接酶緩沖液1 μL，PCR-酶切產物3 μL，pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP 酶切產物2 μL，T4連接酶1 μL，補ddH2O至10 μL。將連接產物轉化E. coli DH5α后，涂布于LA 平皿上過夜培養。第二日，挑取孤立的，圓滑的單菌落進行菌落PCR 實驗，將鑒定結果呈陽性的克隆再接種到LB 液體培養基中，搖菌過夜，次日抽提質粒并進行酶切鑒定。將菌落PCR和酶切鑒定結果均呈陽性的單克隆重組慢病毒載體送測序，并進行基因序列比對，測序工作由寶生物工程有限公司完成。

表1 目的基因PCR循環體系

1.2.4 病毒包裝與濃縮 提取重組慢病毒質粒pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP，濃度保證在1 μg/μL 以上，DNA 的A260/A280在1.8～2.0。取兩支無菌離心管分別加入1.5 mL Opti-MEM，一只管內加入載體質粒和包裝質粒Mix 各6 μg，另一支管內加入POLOdelivererTM3000 轉染試劑24 μL，輕輕混勻，室溫孵育5 min，之后再將兩管液體混合，并輕輕顛倒混勻，靜置孵育20 min。取3 mL 混合液均勻滴加在狀態良好的293T細胞培養皿中，置于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養，分別于48 h、72 h、80 h后收集細胞上清液，先于4℃、3 000 r/min 離心10 min，其上清液經0.45 μm 膜濾器輕輕過濾于離心管中，再經4℃、22 000 r/min 離心2 h，棄上清液，沉淀用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底溶解，最后收集至1.5 mL EP 管內，分裝存于-80℃冰箱。通過采用熒光顯微鏡觀察法來測定慢病毒滴度。

1.2.5 病毒感染293T細胞 感染前1 d取生長狀態良好的293T 細胞以5×104密度接種于12 孔培養板中，使轉染當天細胞密度達到80%左右。實驗分為三組：A，重組慢病毒感染組；B，空載體感染組；C，未感染細胞對照組。A、B 組分別加入100 μL 重組慢病毒液和對照病毒液，同時加入終濃度為8 μg/mL 的Polybrene促進感染，感染24 h后更換新鮮培養液繼續培養，感染72 h后觀察各組熒光表達情況。

1.2.6 qPCR 法檢測目的基因 將感染72 h 后的293T細胞利用Trizol法提取mRNA，經DNaseI處理后反轉錄成cDNA，然后采用qPCR 檢測目的基因Satb2的表達，引物設計如表2。

表2 目的基因qPCR引物設計

2 結果

2.1 重組慢病毒菌落PCR 鑒定 挑取經篩選后呈單克隆生長的菌落進行PCR擴增，電泳得到一條約2 202 bp的亮帶，與目的基因長度相符，見圖1。

圖1 pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP重組載體菌落PCR鑒定

2.2 重組慢病毒酶切鑒定 重組慢病毒載體pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP 用PacⅠ和AscⅠ對其進行雙酶切，最終得到兩條亮帶，大片段約9.1 kb，小片段約2 202 bp，與目的基因相符，見圖2。

圖2 pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP酶切鑒定

2.3 測序結果 將菌落PCR 和酶切鑒定結果均呈陽性的重組慢病毒載體送測序，并進行基因序列比對，結果顯示，Satb2 基因序列與GenBank 報道的序列完全一致，見圖3。

圖3 Satb2測序圖

2.4 慢病毒包裝及滴度測定結果 重組慢病毒pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP 及空載體分別與包裝質粒Mix共轉染293T細胞后，收集、濃縮病毒液，取其中一支病毒液10 倍倍比稀釋后分別感染293T 細胞，感染72 h 后在熒光顯微鏡下觀察結果并選取合適的孔進行細胞計數。根據熒光顯微鏡觀察法的測定公式計算出重組慢病毒滴度為7.9×107ifu/mL，空載體慢病毒滴度為1×108ifu/mL。

2.5 慢病毒感染293T細胞結果 重組慢病毒(A組)及空載體慢病毒(B組)感染293T細胞72 h后，在熒光顯微鏡下可以觀察到大量熒光，感染效率達到70%左右，未感染組(C組)細胞未見熒光表達，見圖4～6。

圖4 重組慢病毒感染293T細胞（A組）

2.6 目的基因Satb2 的表達 慢病毒感染293T細胞72 h 后，利用qPCR 檢測目的基因Satb2 的表達，結果顯示A 組Satb2 mRNA 的表達量增加了約106倍，差異具有統計學意義(P<0.05)，而B 組和C 組目的基因的表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖7。

圖6 正常293T細胞（C組）

圖7 目的基因檢測

3 討論

Satb2 是一種新型特殊富含AT 序列的DNA 結合蛋白，它可以與核基質附著區(nuclear matrix regions，MARs)結合并能以MAR依賴的方式同時激活多個基因的轉錄[5-6]。現有的研究發現Satb2作為一個高級調控因子同時參與了多種重要組織的生物學過程，如在中樞神經系統的發育；顱面形態的形成、發育；成骨細胞的分化、成熟；上腭的形成以及腫瘤的發生等方面都起著重要作用[7-10]。尤其在骨骼發育過程中，Satb2不僅可以通過調節多種特異性成骨基因的轉錄來影響骨組織的形成，而且還可以通過協同作用增強其他轉錄因子如runx2、osx、Atf4的活性來調節骨發生和成骨細胞分化[11-13]，說明Satb2在促進成骨細胞分化和骨再生的過程中是一個強有力的轉錄因子。DOWREY等[14]通過研究推測Satb2 可能通過兩種機制調節骨的增殖，首先Satb2 可能調節前成骨細胞周期變換所必需基因的表達；第二，與其他MAR 結合蛋白類似，Satb2 可能參與DNA 復制。Satb2-/-基因敲除小鼠表現出下頜遠端骨骼發育不全，出生時，缺乏Satb2 的小鼠出現嚴重下頜后縮并死于腭裂[15]。張瑾[4]研究發現，Satb2 在牙胚中表達，說明Satb2在牙齒、牙周組織發育中也起著一定作用。在模擬牙周創傷的小鼠模型實驗中，過表達Satb2 能夠促進骨髓間充質干細胞、牙囊細胞及誘導多能干細胞向成骨細胞分化，從而促進小鼠牙周創傷區的愈合[4]，同樣過表達Satb2的大鼠骨髓間充質干細胞能顯著增強牙科種植體周圍新骨的形成和骨密度[16]，由此說明Satb2 在牙周組織骨再生中發揮了一定作用。BANě?KOVá等[17]發現在牙齦區的骨化和部分非骨化的外周口腔纖維瘤中可檢測到Satb2 的表達，可推斷Satb2 在牙周來源的纖維瘤變過程中也發揮作用。另外，Satb2 相關綜合征是一種新近被描述的臨床綜合征，其特征表現為發育遲緩/智力殘疾、語言發育缺失或受限、顱面異常(包含腭部和牙齒異常)、行為問題和畸形特征等[18-19]。Satb2 基因異常的患者口腔臨床表現可以有牙齒遲萌、夜磨牙、流涎、過大牙等癥狀；影像學表現則有牙根形成延遲、嚴重遲萌或第二雙尖牙缺失、畸形牙和牛牙癥等[20]，說明Satb2 基因異常影響人類牙齒的形成和發育。盡管現有的研究已經證實Satb2 在牙齒發育、牙周組織骨再生等方面發揮了一定作用，但其能否作為牙周組織再生的理想因子仍需要進一步探討和研究。

本實驗通過PCR 技術擴增出目的基因Satb2，然后利用PacⅠ和AscⅠ兩個酶切位點將其插入到慢病毒pLenti6.3-IRES2-EGFP/V5 DEST 之中，從而成功構建了攜帶Satb2 基因的慢病毒表達載體pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP。該慢病毒經過包裝、濃縮，病毒濃度達到7.9×107ifu/mL，我們利用病毒液感染293T細胞后可以觀察到大量熒光，并檢測出目的基因mRNA的過表達，說明我們包裝出的病毒顆粒具有感染活性，從而為進一步研究目的基因Satb2 在牙周組織再生過程中所起的作用奠定了基礎。