二甲雙胍對糖尿病小鼠腸道菌群影響的高通量測序研究

劉慧云，謝強，涂忠亮

豐城市人民醫院內分泌科，江西 宜春 331100

2 型糖尿病是一種代謝疾病，主要病因是由于肥胖導致身體對胰島素產生抗性[1]。二甲雙胍是治療2型糖尿病的有效藥物，具有耐受性好、廉價和口服使用的優點[2-3]。二甲雙胍通過抑制肝臟產生葡萄糖的過程，并且提高身體對胰島素的敏感性，達到降低血糖的療效[4-5]。腸道菌群對身體代謝過程有著重要影響。對人和對小鼠的研究都發現，身體增肥過程中，腸道中厚壁菌門微生物占比升高而擬桿菌門微生物占比相對降低[6-7]。在接受胃旁路手術的人的腸道中，普氏菌屬微生物豐度在肥胖個體腸道內會大幅升高[8]。有研究報道，在益生元喂養的小鼠腸道種雙歧桿菌屬微生物的數量增加有助于小鼠的葡萄糖耐受性，也有助于降低炎癥水平[9-10]。而對1 型糖尿病大鼠腸道微生物的研究發現擬桿菌屬微生物增多時糖尿病癥狀更容易惡化[11]，而乳酸桿菌屬微生物不僅和肥胖相關，還被發現能夠調節腸道中的免疫反應[12-13]。綜合來看，腸道菌群可通過調整體內脂類物質的代謝、葡萄糖的吸收水平、膽汁酸受體的表達以及體內炎性反應的程度來影響糖類、脂類物質的代謝[22]，可以推測腸道菌群既能夠一定程度上反映代謝狀態，也能夠通過影響代謝從而促進或者抑制糖尿病的發展。本研究則利用16S測序手段調查使用二甲雙胍治療2 型糖尿病過程中腸道菌群的變化情況，并重點分析其中梭菌屬、普氏菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬等代謝相關的腸道菌群微生物豐度的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF 級ICR 雄性小鼠20 只(5 周齡，22 g左右)由江西中醫藥大學提供。

1.2 主要試劑 四氧嘧啶(629C021，Solarbio)；鹽酸二甲雙胍(621E024，Solarbio)；Zon Reagent TRIzon總RNA提取試劑盒(1714D，CWBIO)。

1.3 動物造模 SPF 級ICR 雄性小鼠9 只，體質量22 g左右，隨機選3只作為對照組(BMCK、M2WCK和M42CK)，其余6只高糖高脂飲食飼養4周后腹腔注射四氧嘧啶溶液180 mg/kg，3 d 后測小鼠空腹血糖。以空腹血糖大于11.1 mmol/L 為糖尿病小鼠造模成功[14-15]。糖尿病小鼠隨機均分為二甲雙胍治療組(BMMet、M2WMet 和M42Met) 和 模 型 組(BMMod、M2WMod 和M42Mod)。二甲雙胍治療組給與每日兩次二甲雙胍600 mg/mL 灌胃，對照組和模型組給與生理鹽水灌胃。4周后取糞便提取微生物總RNA。

1.4 RNA提取 向小鼠糞便種加入PBS，勻漿后制成懸濁液，用篩子過濾掉渣滓。100×g離心3 min后留沉淀，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸清洗，如此離心重懸2次后得到再次離心收集沉淀的微生物，加入TRIzon，根據試劑盒說明書提取微生物總RNA，得到總RNA后加入RNA酶抑制劑后寄往高通量測序公司。

1.5 數據分析 使用QIIME軟件，調用UCLUST這一序列比對工具，高通量測序所得的序列按97%的序列相似度進行歸并和OTU 劃分，并選取每個OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列，然后比對RDP (Ribosomal Database Project)數據庫得到分類鑒定結果。隨后，根據每個OTU在每個樣本中所包含的序列數，構建OTU在各樣本中豐度的矩陣文件[16-17]。

微生物分類進化等級樹是通過使用GraPhlAn 軟件將每個樣本所含有的OTU 的豐度信息和分類學組成數據映射至NCBI Taxonomy 所提供的微生物分類等級樹而得到的[18]。

PCA分析通過線性變換，將原始的高維數據(如菌群OTU 豐度矩陣)通過線性變換組合，投影到維度較低的空間坐標系(即主成分)中，從而達到降維、簡化數據結構的目的，展現樣本的自然分布[19]。PCA 分析能夠從原始數據中提取樣本間最主要的差異特征，并根據這些差異特征將樣本在新的低維坐標系中依次排序，使得樣本在新坐標系中的距離遠近能在最大程度上還原樣本間的實際差異。通過R 軟件對PCA 分析得到的二維數據作圖，可以得知群落樣本的主要分布特征，從而量化樣本間的差異和相似度。

2 結果

2.1 腸道微生物16S 測序定性分析結果 可操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)指根據序列相似度設置閾值，將測序得到的各樣本的序列進行歸并，彼此間相似度高于該閾值的序列都將歸并為一個OTU。目前大多數基于16S rRNA基因的菌群結構多樣性研究中，通常都以97%的序列相似度作為OTU 劃分閾值，該閾值大致相當于分類學中物種(Species)水平的序列差異。

將豐度值低于全體樣本測序總量0.001% (1/100 000)的OTU 去除后進行OTU 劃分并對分類地位[21]鑒定結果進行統計，見表1。

表1 腸道微生物16S測序分類鑒定統計

對OTU 豐度矩陣中每個樣本的序列總數在不同深度下隨機抽樣，以每個深度下抽取到的序列數及其對應的OTU數繪制稀疏曲線。如圖1所示，圖中各樣品曲線隨測序深度增加已經變得平緩，表明測序結果已足夠反映當前樣本所包含的多樣性。

腸道微生物分類進化等級樹分析結果如圖2所示。在門水平豐度最高的是A.厚壁菌門(Firmicutes)，K.擬桿菌門(Bacteroidetes)次之。在屬水平豐度最高的是J.乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，F.異桿菌屬(Allobaculum)次之。

2.2 腸道微生物豐度比較 各樣本在門分類水平所含有的微生物類群數量，如圖3所示；各樣本在屬分類水平所含有的微生物類群數量，如圖4所示；總體豐度前50 位的屬在各組樣品中豐度水平，如圖5 所示。3個糖尿病模型組小鼠腸道微生物中都出現了乳酸桿菌屬微生物顯著減少的情況，而其中兩個出現了Allobaculum屬微生物增多的情況；而3 個二甲雙胍治療糖尿病組小鼠腸道微生物中都出現了乳酸桿菌屬微生物恢復性增多的現象。

圖1 稀疏曲線(Rarefaction curve)

圖2 分類等級樹

圖3 門水平分類學組成和分布圖

圖4 屬水平分類學組成和分布圖

圖5 總體豐度前50位的屬在各組樣品中豐度水平

圖6 組間PCA分析

2.3 代謝相關的腸道微生物變化情況比較 將每組的三只小鼠的腸道微生物豐度數據取平均值，然后對三組的數據進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，組間PCA 分析結果見圖6。根據文獻選擇了梭菌屬、擬桿菌-普氏菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬等代謝相關的腸道微生物種群進行組間豐度變化情況分析，根據PCA 分析結果，每個屬的微生物中選擇組間差異最大的兩種微生物，篩選出的微生物在組間豐度變化情況見表2～表6。其中梭菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬微生物出現了二甲雙胍處理組的微生物豐度在對照組和模型組之間的情況。

表3 擬桿菌-普氏菌屬(Bacteroides-Prevotella)差異情況

表2 梭菌屬(Clostridium)差異情況

表5 乳酸桿菌屬(Lactobacillus)差異情況

表4 擬桿菌屬(Bacteroides)差異情況

表6 雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)差異情況

3 討論

本研究試圖增加對兩個問題的了解，一是對糖尿病模型組小鼠的腸道微生物和對照組小鼠的正常腸道微生物進行比較，研究糖尿病造模導致模型小鼠血糖水平保持在偏高的狀態下對腸道微生物的影響；二是對糖尿病模型組小鼠腸道微生物和接受二甲雙胍灌胃給藥的糖尿病小鼠腸道微生物進行比較，研究二甲雙胍灌胃給藥而降低血糖水平的條件下有哪些微生物的豐度更接近正常組的狀態，并且研究二甲雙胍本身對小鼠的腸道微生物是否有顯著的影響。

從各腸道菌群樣本在門分類水平所含有的微生物類群數量可以發現，厚壁菌門和擬桿菌門是豐度最高的一塊，占總微生物80%以上的比例。三只模型組小鼠相對于正常組小鼠，都出現了厚壁菌門微生物占比降低而擬桿菌門微生物占比升高的現象。二甲雙胍治療組小鼠相對于模型組小鼠，有2 只小鼠出現了厚壁菌門微生物占比上升而擬桿菌門微生物占比下降的現象，可以認為這2 只二甲雙胍治療組小鼠的厚壁菌門和擬桿菌門微生物豐度水平向正常組的狀態轉化。而二甲雙胍治療組的另一只小鼠出現了擬桿菌門微生物占比下降的現象，但是疣微菌門(Verrucomicrobia)的微生物占比大幅上升，厚壁菌門微生物占比變化幅度不大。其他研究中發現腸道微生物中厚壁菌門微生物占比升高而擬桿菌門微生物占比降低有助于身體肥胖[6]，本實驗則發現發現糖尿病造模對厚壁菌門和擬桿菌門微生物的占比有著相反的效果，可以推測糖尿病狀態下身體保持高血糖水平，糖分轉化為脂肪過程受抑制等代謝狀態也反映到腸道微生物豐度水平上。

進一步細化到屬分類水平，可以發現相對于正常組，3 個糖尿病模型組小鼠腸道微生物中都出現了乳酸桿菌屬(屬于厚壁菌門)微生物顯著減少的情況，而3個二甲雙胍治療糖尿病組小鼠腸道微生物中都出現了乳酸桿菌屬微生物恢復性增多的現象。在各個樣品中乳酸桿菌屬微生物的豐度在厚壁菌門微生物中數一數二，可以認為乳酸桿菌屬微生物在菌群變化中起著決定性的作用。而在M4WMet 小鼠腸道微生物中占比大幅上升的疣微菌門微生物基本上是阿克曼西亞屬(Akkermansia)微生物。有研究報道，二甲雙胍給藥的肥胖小鼠腸道微生物中阿克曼西亞屬屬和梭菌屬微生物占比顯著上升，而且具有抑制脂肪代謝過程的效果[20]。本研究在進一步的數據分析中選擇了梭菌屬、擬桿菌-普氏菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬等與肥胖或者糖尿病相關的腸道微生物種群進行組間豐度變化情況分析，根據PCA分析結果每個屬的微生物中選擇組間差異最大的兩種微生物，篩選出的微生物在組間豐度變化情況顯示其中梭菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬微生物出現了二甲雙胍處理組的微生物豐度在對照組和模型組之間的情況，也就是說二甲雙胍給藥讓糖尿病小鼠腸道中梭菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬微生物豐度向正常狀態轉變，可以推測這三個屬的微生物與二甲雙胍治療糖尿病的過程有較高的相關性。

綜上所述，受二甲雙胍影響，糖尿病小鼠腸道菌群微生物會更傾向抑制脂肪代謝減輕肥胖，達到有利于減輕糖尿病的效果。而梭菌屬、擬桿菌屬和乳酸桿菌微生物可以作為二甲雙胍對腸道菌群影響的標志性微生物。